[发明专利]一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽及其制备方法和治疗多重耐药菌感染的应用。

背景技术

截至目前，600多条抗菌肽(又称之为阳离子宿主防御肽，AMPs)已经被证实不仅能够杀死革兰氏阳性 菌、革兰氏阴性菌、病毒、原虫和真菌等致病微生物，而且在招募巨噬细胞和增强先天免疫系统作用中发 挥重要作用。与传统的抗生素相比，抗菌肽杀灭细菌的速度快的多，涉及到细菌细胞内多个靶点。它们能 够作为抗菌剂而被单独使用，也能结合其它的抗生素而发挥协同效应，或者作为免疫调节剂和中和内毒素 物质。最值得关注的是，抗菌肽被公认为是不可能产生完全耐药性的。因为它主要是通过物理渗透作用于 细菌胞膜，微生物很难改变自身的胞膜(磷脂双分子层)结构，从而使微生物不易对其产生耐药性。另外， 抗菌肽在微生物体内有多个作用靶点，减少胞内任何一个作用靶点，都不会使其耐药性增加很多。同时， 抗菌肽和其它的抗菌肽或传统的抗生素联合应用，不会发生交叉耐药。抗菌肽不易产生耐药性的优越性质， 为人们寻找理想的抗菌药物提供了新的领域，为人类战胜耐药微生物带来了新的契机，抗菌肽也因此具有 巨大的研发和应用的潜力。

尽管自然界发现的天然抗菌肽和人工改造、设计合成的抗菌肽种类繁多，但是抗菌肽应用于临床的成 功率却很低。其主要原因是抗菌肽在研发中还存在一些亟待解决的问题：第一，毒性问题是其不能应用于 全身的主要原因。抗菌肽主要通过破坏细菌细胞膜而发挥杀菌作用，选择性不高，非选择性的细胞毒作用 易使红细胞膜破裂溶血。如多粘菌素类和短杆菌肽S在临床使用中毒性太大，不能作为抗菌剂或抗内毒素 剂全身使用，只能被局部联合使用。第二，稳定性问题是其临床应用的第二大难点。抗菌肽是小分子量的 蛋白质，易被蛋白酶水解，体内半衰期短。第三，抗菌肽体内外活性存在差异。尽管许多抗菌肽在体外显 示出明显的抗菌活性，但在生理盐浓度和血浆条件下，许多抗菌肽的活性丧失。而有些宿主防御肽在体外 无抗菌活性，在体内却能通过免疫调节而发挥抗菌作用。第四，生产成本昂贵是限制其临床应用的直接原 因。抗菌肽的来源十分困难：天然提取资源有限，分离纯化工艺复杂，成本高；化学合成相对于抗生素来 说，成本也高得多，产业化困难；基因工程表达则抗菌活性差、易导致宿主细胞自杀，难以用常用的细菌、 病毒做表达体系，且表达产量不高。因此，急需改造分子量大、生产成本高的天然肽为分子量小、生产成 本相对低的人工肽，从而最终降低其生产成本。

最近在含半胱氨酸稳定的抗微生物多肽、毒素、毒液、kinocidins和宿主防御肽等许多多肽中发现了 一个结构模序——γ-核心模序。它是一个具有遗传进化标志的保守三维结构模序，是由特定氨基酸序列组 成的双向定向结构。Thanatin是目前发现的具有γ-核心模序的最简单的抗菌肽。对革兰氏阴性菌具有较强 的抗菌活性，毒性低，稳定性好。本发明通过截短、替换、移位和环化对thanatin序列进行改造，得到具 有不同抗菌谱、低毒、稳定的含γ-核心模序的新型环化抗菌肽。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一组新型抗菌肽。

本发明需要解决的技术问题之二是提供一组新型抗菌肽的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。

本发明的构思如下：改造设计的主要思路是保持thanatin的遗传进化标志(γ-核心模序)，用6条天然 存在的含γ-核心模序抗菌肽β隆起部位的氨基酸序列替换thanatin的相应部位序列，得到一系列新的序列； 截掉这些序列N-末端的8个氨基酸，又得到一系列新的序列；在此基础上再截掉这些序列C-末端的1个 氨基酸，又得到仅保留γ-核心的一系列新的序列，上述所有多肽链的C-末端均进行酰胺化，肽链内的两个 半胱氨酸均环化形成一个胱氨酸。经过改造后筛选到以下37条序列具有不同的抗菌活性，而溶血毒性基 本没有变化，非常有希望用于治疗细菌感染的新药的开发。

本发明提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的这一系列序列 被命名为DS，序列如下：

Thanatin

DS01

DS02

DS03

DS04

DS05

DS06

DS07

DS08

DS09

DS10

DS11

DS12

DS13

DS14