[发明专利]一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，尤其是利用秦巴山区天然资源的秦巴绞股蓝中草药中提取、分离、纯化一种中性多糖的方法。

背景技术

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，具有增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化等作用，且安全无毒。目前，全世界已知绞股蓝植物有13种，我国占11种，其中7种为我国独有，占全部种数的53.8％。绞股蓝主要分布在亚洲一些国家，在我国应属陕西绞股蓝资源最为丰富，主要分布在以秦巴山区为中心的37个县市，安康、平利等县市目前已成为我国绞股蓝最大的生产基地，所产绞股蓝品种最为优良。

近年研究发现绞股蓝多糖是绞股蓝的有效活性成分之一，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳等药理作用。目前国内外对绞股蓝多糖的研究普遍停留在粗多糖水平，主要集中在粗多糖提取和生物活性等方面的研究。中国专利公开号CN1098298A所述的绞股蓝多糖的提取技术，得到的多糖含有蛋白质、色素等其他成分。中国专利公开号CN 1490338A所用技术，虽然进行了除蛋白处理过程，但是缺少脱色等程序，此方法得到的绞股蓝多糖也只是粗品，含有大量色素等其他成分。目前尚未分离纯化得到均一的绞股蓝多糖组分。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，可以制备得到均一的绞股蓝多糖组分。

技术方案

一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制备由3步实现：先自绞股蓝中制备得到粗多糖，然后制得精制多糖，由精制多糖制备得到中性多糖；具体步骤如下：

步骤1：将95％乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中，在50±2℃的温度下搅拌1小时，然后过滤收集滤渣；再将滤渣采用95％乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；再将滤渣采用95％乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；将滤渣自然风干后加入6-10倍相对滤渣质量重的蒸馏水，在90-95℃下搅拌10-12h，过滤收集滤液，重复2-3次；将上述每次收集得到的滤液合并，在50℃下抽真空减压浓缩，在流动水中透析48h；

步骤2：向步骤1得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇，在4℃下保存10-12h；然后用高速离心机在5000rpm离心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤，再40-45℃真空干燥6h，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖；

步骤3：将粗多糖加双蒸水配成浓度为5％的水溶液，用1mol/L HCl调节pH为5.5，加入粗多糖质量1/20的木瓜蛋白酶在65℃恒温下搅拌3h后加热至100℃终止酶反应；

步骤4：加入双蒸水将步骤3得到的溶液稀释至0.5％，滴加浓氨水将pH值调至8.0，于50℃边搅拌边逐渐加入30％H₂O₂，搅拌3～5小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色，停止搅拌在50℃下抽真空减压浓缩；

步骤5：向步骤4得到的浓缩液加入其体积1/5的sevag试剂，震荡20min，放入高速离心机中在5000rpm离心15min；离心完后收集上清液，再加入其体积1/5sevag试剂，重复5次；将得到的上清液用蒸馏水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍体积的乙醇，在4℃放置10-12h；放入高速离心机中在5000rpm离心10min，离心完后收集沉淀，依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥12h，得到白色绞股蓝精制多糖；

步骤6：将精制绞股蓝多糖1g溶于50mL双蒸水，5000rpm离心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上样量为交换容量的10％～20％；

步骤7：将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0～1mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液，在50℃下减压浓缩，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖。

有益效果

本发明提出的一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，是一种从绞股蓝中提取、分离、纯化的中性多糖的制备方法。本发明利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用水提法浸提，并用乙醇分级沉淀法分离，最后用阴离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化多糖。

附图说明

图1秦巴绞股蓝精制多糖的DEAE-52 cellulose柱层析

图2 GPMPA的Sephadex G-100凝胶柱层析

图3 9种单糖标准品糖腈衍生物GC图

图4 GPMPA糖腈衍生物GC图

具体实施方式