[发明专利]一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法

权利要求书

1.一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物，提高其抗凝血活性、降低其结合血小板因子能力的方法。

2.如权利要求1所述的肝素衍生物的制备方法，该方法由下列步骤组成：

(1)用硫酸乙酰肝素3-O-硫酸基转移酶，通过酶硫酸化反应，将PAPS的硫酸基选择性的转移到肝素氨基葡萄糖3-OH位置，提高3-O-硫酸基含量，合成产物I；

(2)用硫酸乙酰肝素6-O-脱硫酸基酶处理合成产物I，通过酶去硫酸化反应，选择性脱掉非还原末端为艾杜糖醛酸的氨基葡萄糖6-O硫酸基，降低6-O-硫酸基含量，合成产物II；

(3)用硫酸乙酰肝素2-O-脱硫酸基酶处理合成产物I，通过酶反应，选择性脱掉艾杜糖醛酸2-O硫酸基，降低2-O-硫酸基含量，合成产物III；

(4)对合成产物III进行脱盐、透析、干燥，得到白色粉末，极为本方法制备的肝素衍生物。

所宣称的肝素，指从动物内脏的肥大细胞中分离纯化出的肝素钠盐。

所宣称的硫酸乙酰肝素3-O-硫酸基转移酶、6-O-脱硫酸基酶、2-O-脱硫酸基酶指与硫酸乙酰肝素生物合成有关的酶，可以从人、动物或微生物中分离得到，也可以通过分子生物学的技术制备。

所宣称的酶反应，指在一定的pH、缓冲液、温度，用特定的酶催化进行的反应。

所宣称的肝素衍生物是一种硫酸化多糖的钠盐，为白色粉末，分子量在5000-8000，糖醛酸和氨基葡萄糖的组成为1：1，每个糖单元约含1.5个硫酸基，其中3-O-硫酸基含量占整个硫酸基含量的5-10％，N-硫酸基含量为50-60％，2-O-硫酸基硫酸基含量为10-15％，6-O-硫酸基硫酸基含量为10-15％。

3.权利要求2中宣称的酶硫酸化反应，指在由50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％ Triton X-100，1％BSA，1mMMgCl₂，1mM MnCl₂，1mM PNPS，40μM PAP，8mg 3-OST-1(或3-OST-5)及4mg AST-IV组成的反应液中进行的反应，于20-40℃下震荡反应2-6h。

4.权利要求2中宣称的酶硫酸化反应，指在由50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％Triton X-100，1％BSA，1mMMgCl₂，ImM MnCl₂，1mM CaCl₂组成的反应液中进行的反应，于20-40℃下震荡反应2-6h。

5.权利要求2中宣称的干燥，可以是真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。