[发明专利]利用固定化脂肪酶制备地尔硫卓手性前体的装置及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用固定化脂肪酶水解底物制备地尔硫卓手性前体的装置及方法。

技术背景

地尔硫卓是一种钙离子通道阻滞剂，被广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采用 来自沙雷氏杆菌(Serratia marcescens ECU1010，保藏号CGMCC No.1219)的脂肪酶拆分(±)- 对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，不需要的(+)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被脂肪酶选择性地水 解，(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被保留下来，可用于合成地尔硫卓。

固定化酶具有回收容易、可反复使用的优点。与分批操作方式相比，以固定化酶为催 化剂、利用反应器实现连续或半连续获取产物，有助于减轻劳动强度、减少辅助操作时间、 提高生产强度。

文献Journal of Fermentation and Bioengineering 1994，78：59-63介绍了一种利用膜进行脂 肪酶固定化及拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯获得(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的反 应器和方法。其不足之处在于反应器所用膜必须是由耐有机溶剂的特殊材料制成，装置成 本高。

发明内容

本发明的目的在于，提供利用固定化酶连续或半连续制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲 酯的装置和方法，减少辅助操作时间。

本发明通过以下方案实现：

(1)采用Serratia marcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)按专利ZL 200410067046.1所公开的方法发酵获得脂肪酶。

(2)用壳聚糖-戊二醛交联方法进行脂肪酶的固定化。

第一步，制备固定化载体。将0.5-2g壳聚糖，溶于20-50ml 1.5-4％的醋酸溶液中，用 注射器逐滴滴到5-20％NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。

第二步，固定化载体活化。将获得的壳聚糖载体投入到50ml 0.5-3％的戊二醛水溶液中， 30℃振摇2-12h，选择孔径大小为100目、120目尼龙网过滤(截留直径大小约为120微米 到150微米的壳聚糖载体)，洗涤。第三步，酶固定化。投入50ml发酵液中，4℃搅拌固定 化2h，抽滤、洗涤。固定化酶备用。

(3)将固定化脂肪酶置于带有搅拌的釜式反应器中，此反应器可控温、调pH，并带 有可拆卸的、带孔径大小为200目的框，固定化酶便放在此部件中。

(4)进行半连续反应时，向装有固定化酶的反应器加入含有底物(±)-对甲氧苯基缩水 甘油酸甲酯的甲苯和等体积的水，搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。不 断检测，当剩余底物的ee值高于99％时，从反应器底部排出料液，固定化酶被拦截在反应 器内，不随料液排出。固定化酶不需清洗，重新加入含有底物的甲苯和水，继续反应。

当固定化酶达到半衰期后，直接将框从反应器内取出，完全倾出固定化酶，加入新的 固定化酶，重新放入反应器内。反应器其它部件不需拆卸、清洗。

(5)进行连续反应时，向装有固定化酶的反应器加入含有底物(±)-对甲氧苯基缩水甘 油酸甲酯的甲苯和等体积的水，搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。不断 检测水解过程。当剩余底物的ee值高于99％时，从反应器顶部流加含有底物的甲苯和水， 按同等速度从反应器底部排出料液。整个过程，维持料液ee值高于99％。

具体实施方式

实施例1：

固定化载体：将0.5g壳聚糖，溶于20ml 2.5％的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到20％ NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。

将获得的壳聚糖载体投入到50ml 1％的戊二醛水溶液中，30℃振摇12h，抽滤，洗涤。 投入50ml脂肪酶发酵液(5000U/L)中，4℃搅拌固定化2h，抽滤、洗涤。

表1壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶

实施例2：