[发明专利]抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用

说明书

技术领域

本发明抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用涉及的是生物医学领域，具体涉及一种能识别狂犬病病毒的单克隆抗体的制备及其应用。 

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的世界性人兽共患传染病。人和动物一旦发病死亡率高达100％。全球每年约有55,000人死于狂犬病，主要集中在亚非拉发展中国家。人类患者多因病畜咬伤而感染，出现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征的中枢神经系统感染疾病。该病流行广、宿主多，几乎所有温血动物都能被感染，以各种哺乳动物为主要宿主，是一种危害非常严重的人畜共患急性传染病，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，也是人类尚未能有效控制的疫病之一。 

狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属。病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。外壳为一紧密完整的脂蛋白双层包膜，表面嵌有数量众多的由病毒糖蛋白构成的槌状包膜突起，它覆盖了除平端外的整个病毒表面，是病毒主要的表面抗原，也是病毒惟一的糖基化蛋白。病毒包膜内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白。膜蛋白内侧为病毒核心，即一个直径为40nm的核衣壳，由核酸和紧密 包在它外面的核蛋白所构成，呈紧密的连续性螺旋形式，有30～35个卷曲，另外2种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称RNA多聚酶和磷酸化蛋白。 

目前，对于狂犬病病毒检测的方法主要有病毒形态学观察、组织病理学检测、小鼠颅内接种分离狂犬病病毒法等，但操作较为繁琐，或需要使用电镜等设备。近年来从动物和人类唾液中检测狂犬病毒抗原的方法也有较大发展，如酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光技术(IFA)，具有快速、特异敏感、不受标本量限制、节约试剂和试验成本费用较低等优点。Kohler和Milstein于1975年创立的B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体(monoclonal antibodies，McAb)技术，作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其应用价值和开发前景已获得普遍的肯定。 

而目前在我国流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平刚(2006)等从系统进化树上分析表明，CTN株与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近。 

发明内容

本发明的目的是针对上述检测方法操作较为繁琐，或需要使用电镜等设备不足之处，提供一种抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用，是一种能识别狂犬病病毒的鼠源性单克隆抗体，该抗体对狂犬病病毒的选择性强。 

本发明公开的能识别狂犬病病毒的鼠源单克隆抗体是一种以与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近的CTN株灭活病毒为抗原，同时 用该病毒包被ELISA板，对得到的抗体进行筛选而获得的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。 

本发明抗狂犬病病毒的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5所分泌的。 

抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5已于2009年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3014。该鼠源杂交瘤细胞株2C5也属于本发明的保护范围。 

抗狂犬病病毒的单克隆抗体的制备方法： 

1、免疫原准备与免疫 

免疫原的制备  采用灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒(纯度99％以上，武汉病毒所张爱华惠赠)。 

动物免疫  将上述灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒经测定蛋白浓度为0.67mg/mL，按1∶1加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按100μg(0.3mL/只)免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200μg纯化抗原加强免疫，三天后融合。 

2、杂交瘤细胞的融合 

按常规方法进行杂交瘤细胞的融合。在融合前摘眼球法取阳性血备用。取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合。 同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清。融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测。 

3、杂交瘤细胞的检测