[发明专利]一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，是一种利用离子交换树脂直接提取、作为原料药或保健食品功效成分的蚯蚓纤溶酶的工业化生产技术，属于生物技术领域。

二、背景技术

选用适合的树脂在适当的条件下进行离子交换或吸附层析，直接从动植物或微生物粗提液中、直接从发酵液中提取-浓缩目标蛋白或目标多糖或其他生化物质，是目前最常用的快速简便、成本低廉的工业化分离纯化技术。

蚯蚓纤溶酶亦称蚓激酶，作为口服溶血栓药的主要原料药在我国与日本已经应用多年，同时还有若干种以蚯蚓纤溶酶为功效成分的保健食品上市，两大类产品在我国年销售额已超过10亿元，目前仍呈快速上升趋势。

蚯蚓纤溶酶的实验室提取、提纯，通常采用蚯蚓匀浆-抽提-离心-硫酸铵分级盐析或有机溶剂分级沉淀-透析或凝胶过滤、脱盐-离交层析或亲和层析-透析-冷冻干燥。

药用蚯蚓纤溶酶的工业化提取，在我国和日本目前是将鲜蚯蚓(或蚯蚓粉)加水(或0.1mol/LNaCl)保温、搅拌、自溶，或者蚯蚓匀浆加水(或0.1mol/LNaCl)抽提-离心或过滤取上清-硫酸铵分级盐析或乙醇、丙酮等有机溶剂分级沉淀-超过滤、洗涤、浓缩-冷冻干燥或有机溶剂沉淀、真空干燥。有的还插入活性炭等吸附剂吸附、脱色、脱腥工序。

上述工业化制备蚯蚓纤溶酶的生产工艺，缺点是收得率低、产品纯度和生物活性较低、生产成本高、需要耗费大量硫酸铵或乙醇、丙酮等化工原料。因此，寻找一种简易、高效的工业化制备蚯蚓纤溶酶生产工艺，取代目前国内外采用的生产工艺，是一项具实用价值的迫切任务。

三、发明内容

技术问题

本发明是针对目前蚯蚓纤溶酶工业化生产工艺收得率低、产品纯度和生物活性较低、生产成本高、需要耗费大量硫酸铵或乙醇、丙酮等化工原料等缺点，公开一种简易、高效的工业化制备蚯蚓纤溶酶的工艺技术。该提取工艺的核心工序：离子交换，即直接从蚯蚓粗提液中提取并浓缩纤溶酶。蚯蚓纤溶酶的收得率、生物活性得到提高，生产周期缩短、生产成本降低。

技术方案

利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，包括：

(1)洗净的鲜蚯蚓或冷冻的鲜蚯蚓加0.14mol/L NaCl溶液、匀浆，搅拌提取1-2小时，离心或过滤取上清液，沉渣加0.14mol/L NaCl溶液搅拌提取0.5小时、离心、合并上清；

(2)上清液用1mol/L NaOH调节pH7.5-9.5，加无离子水调节离子强度(按电导率计)至1-5ml/Ω；

(3)静态离子交换-阶梯洗脱：加入活化的大孔阴离子交换树脂搅拌交换2-4小时、抽干；常水漂洗、抽干，重复洗涤一次；加入0.8-1.2mol/L NaCl溶液搅拌洗涤、抽干，重复洗涤一次；加入2.5-4.5mol/L pH 5-6NaCl溶液搅拌洗脱2-4小时、抽干、收集洗脱液，重复洗脱1次、合并洗脱液；

或者采用动态离交层析-梯度洗脱：活化的树脂装层析柱，第(2)项下的上清液上柱，无离子水洗涤，0.5-4.5mol/L pH 5-6NaCl溶液梯度洗脱，收集、合并纤溶酶洗脱峰；

(5)洗脱液用冷酒精或冷丙酮沉淀，有机溶剂脱水，真空干燥；或者洗脱液通过超过滤洗涤、浓缩，冷冻干燥。

所用大孔阴离子交换树脂是指大孔强碱性阴离子交换树脂或大孔弱碱性阴离子交换树脂如D254、D290、ZGA351或ZGA451。

有益效果

目前国内外普遍利用赤子爱胜蚓(Eisenia Foetide)作为提取纤溶酶的原料，赤子爱胜蚓至少含有6种纤溶酶的同工酶，它们的分子量范围在2.5-4.5万D.，等电点范围3.5-4.5，pH稳定范围5-12，完全失活温度70℃、60分钟。对于这种稳定的酸性蛋白，选择适合的阴离子交换树脂直接从蚯蚓粗提液中提取，照理并不十分困难，但实际并非如此。正因为此，至今国内外仍沿用硫酸铵或有机溶剂分级沉淀从蚯蚓粗提液中提取纤溶酶。即便利用离子交换、疏水层析、亲和层析等提纯技术，也只能放在初步分离提纯之后才能有效地进行。

我们的试验证明，是因为生产过程中含量占细胞核98％以上、等电点pI1.0左右的DNA及其降解产物-分子量大小不一的核苷酸，干扰并阻碍了蚯蚓纤溶酶与离子交换树脂的结合与洗脱。只有消除了数量与荷电量占绝对优势的DNA与核苷酸的干扰，才有可能利用适合的离子交换树脂直接从蚯蚓粗提液中提取、浓缩蚯蚓纤溶酶。