[发明专利]一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法

说明书

技术领域

一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，属于固定化果糖基转移酶的技术领域。

背景技术

低聚果糖(Fructooligosaccharides，简称FOS)，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由蔗糖和1～3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。它是利用微生物或植物中具有果糖基转移活性的酶作用于蔗糖而得的，反应过程可以用以下反应式表示：

低聚果糖是一种保健食品，具有很多对人体有益的功能，如它热量低，不引起龋齿，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义；目前国内工业化生产FOS的技术多为液体深层发酵法，即用液体深层发酵法培养能产果糖基转移酶的微生物，从培养液分离收集菌丝体后，不经任何处理，直接投入蔗糖溶液中，使其转化为FOS。但该法的缺点是产酶菌丝体只能利用一次，在FOS生产过程中，由于菌丝体及其培养基成分的存在并参与反应，不但使整个工艺繁杂，且成本高。至于菌体细胞的代谢物就只能作为杂质残留在产品中，无法除去，也会影响产品的质量。因此，大量生产低聚果糖中的主要问题是生产的产率不高，进而导致蔗糖酶解过程中果糖基转移酶的成本过高，而酶的固定化技术为提高果糖基转移酶的使用效率、降低成本，提供了可能性。因为固定化酶比游离酶具有较好的稳定性，并且可以回收和重复使用，又便于连续化操作，因而可以大大降低成本。

虽然固定化酶在很多方面优于游离酶，但是只有少数固定化酶在工业中作为催化剂，这主要是因为固定化成本高或固定化效果差等原因限制其使用。进入90年代后，对果糖基转移酶的固定化也已出现了多种方法，但这些方法或者是过于复杂或者是FOS产率过低，尚不能十分令人满意。树脂是工业上使用最广的材料之一，它价格低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，作为固定化载体使用有广阔的应用前景。在果糖基转移酶的固定化中虽曾有以D201树脂为载体，但酶活回收率仅为30.2％，远低于本发明81.24％的酶活回收率，所以本发明从多种树脂中筛选出具有较好固定化效果的载体，以较低的成本、较温和及简单的操作条件获得较高的酶活回收率，具有一定的实际意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法。该方法过程简单，所制备的固定化果糖基转移酶具有价格低廉，酶活力和酶活回收率高等优点，利用此法制备的固定化酶，最高酶活可达324U/g树脂，酶活回收率最高可达81.2％。

本发明的技术方案：一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分，工艺步骤如下：

(1)游离果糖基转移酶的制备：

将产酶黑曲霉经发酵培养，离心收集菌体，加菌体质量5-10倍量的缓冲液破壁提取其胞内酶，冷冻离心，超滤浓缩得粗酶液，冰箱保藏备用；

浓缩粗酶液用柠檬酸-磷酸缓冲液稀释至一定浓度并调节pH 3-7.6，游离果糖基转移酶稀释酶液的酶活90-120U/mL；

(2)果糖基转移酶的固定化：

树脂的预处理：以大孔阴离子交换树脂D380、D296R、或D301-III(上述三种树脂全为南开大学化工厂产品)为固定化载体，大孔阴离子交换树脂先用蒸馏水浸泡胀润，除杂，然后用质量浓度4％的NaOH溶液浸泡4h，再用4％的HCl溶液浸泡4h，然后用去离子水冲洗至中性，最后用树脂2倍体积以上去离子水浸泡，湿树脂于4℃冰箱中保存备用；

酶的固定化：称取0.5g所得湿树脂于三角瓶中，加入10mL的游离果糖基转移酶稀释酶液，在pH 6.0～7.0、20-30℃下，以100-200rpm的转速振荡吸附2-8小时后取出；加入稀释酶液总体积0.01％-0.05％的质量浓度为25％的戊二醛溶液，于4-10℃、60-80rpm缓慢振荡下交联4-8小时后，过滤，用缓冲溶液洗涤，冲洗戊二醛残留及未固定上的游离酶，直至洗出液中无酶活力，即得固定化果糖基转移酶，用缓冲液浸泡待用。

破壁提取酶的方法采用超声波细胞破碎法或超高压细胞破碎法，菌体破壁、浓缩、及稀释后稀释酶液的酶活90-120U/mL。