[发明专利]L-茶氨酸酶法转化制备方法有效
申请号: | 200910027192.4 | 申请日: | 2009-05-25 |
公开(公告)号: | CN101560532A | 公开(公告)日: | 2009-10-21 |
发明(设计)人: | 焦庆才;张飞;刘均忠;熊吉滨;刘茜 | 申请(专利权)人: | 南京大学 |
主分类号: | C12P13/04 | 分类号: | C12P13/04;C12R1/125;C12R1/19 |
代理公司: | 南京知识律师事务所 | 代理人: | 胡锡瑜 |
地址: | 210097*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 氨酸 转化 制备 方法 | ||
一、技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及L-茶氨酸的酶法转化制备方法。
二、背景技术
L-茶氨酸(L-Theanine)是一种存在于茶叶中的天然氨基酸,其结构式为: CH3CH2NHCOCH2CH2CH(NH2)COOH。它是茶叶中的主要游离氨基酸和主要呈 味物质。由于L-茶氨酸具有降低血压,松弛神经,减肥,抗疲劳,提高免疫力 等多种生理功能,所以在食品、保健品及药品领域应用广泛。
根据目前文献报导,L-茶氨酸的制备方法主要有以下三种:
1、从茶叶中提取
茶叶中L-茶氨酸含量较为丰富。该法用开水浸泡茶叶,然后用有机溶剂萃 取和离子交换分离来提取L-茶氨酸。目前该法存在的主要问题是工序多,得率 比较低,成本较高。
2、化学合成法
1942年,以色列人N.Lichtenstein(J.Am.Chem.Soc.,1942,64,1021-1022) 首次在实验室用吡咯烷酮酸和33%乙胺水溶液反应得到茶氨酸,该方法收率较 低。
2004年,陈新等(CN 1280261C,2004)用L-吡咯烷酮酸与无水乙胺,在 抗氧化剂存在或用干燥乙胺气体排尽空气环境下进行反应,L-茶氨酸收率达 58%。
2005年,焦庆才等(CN 1228314C,2005)用邻苯二甲酰基作为保护基, 脱水生成N-邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐,与2mol/L乙胺水溶液反应生成中间产物 N-邻苯二甲酰-L-茶氨酸,以水合肼反应除保护基,L-茶氨酸收率超过50%。
虽然化学合成法比从茶叶中直接提取步骤更简单,但化学合成过程中需要 对活性基团进行保护和去保护,并且合成出来的茶氨酸常含有D型产物,需要 经拆分才能得到L型茶氨酸。
3、酶法合成
近年来微生物酶法合成L-茶氨酸发展迅速,常用的酶有谷氨酰胺酶、谷氨 酰胺合成酶和γ-谷氨酰转肽酶。
2002年,日本人H.Suzuki等(Enzyme and Microbial Technology,2002,31(6), 884-889)首次利用从转基因大肠杆菌SH642(含有重组质粒pUC18-GGT)中 得到的γ-谷氨酰转肽酶作催化剂,以L-谷氨酰胺和乙胺混合溶液为底物生物催 化合成L-茶氨酸,底物转化率为60%。
2005年,日本太阳化学株式会社立木隆等(CN 1688705A,2005)利用从 土壤中分离的具有谷氨酰胺酶活性的香茅醇假单胞菌GEA作为L-茶氨酸产生 菌,以L-谷氨酰胺和乙胺为底物合成L-茶氨酸。
2007年,王贤波等(茶叶科学,2007,27(1),61~66)利用转基因大肠 杆菌(含有重组质粒pET-GGT),催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成L-茶氨 酸,L-谷氨酰胺转化率为48.22%。
2007年,日本人Senba Hisao等(JP 2007185132A)利用谷氨酰胺酶催化 L-谷氨酸-γ-乙酯和乙胺反应生成L-茶氨酸,L-谷氨酸-γ-乙酯转化率为71%。
2008年,贾晓鹤等(食品工业科技,2008,29(2),166~169)利用转基 因大肠杆菌(含有重组质粒pET28a-GGT)粗酶液作为催化剂,催化L-谷氨酰 胺和乙胺合成L-茶氨酸,L-谷氨酰胺转化率达到57.8%。
2008年,江波等(CN 101343618A,2008)利用具有γ-谷氨酰转肽酶活性 的枯草芽孢杆菌SK11.004(CCTCC NO:M 208083),催化L-谷氨酰胺和乙胺合 成L-茶氨酸,转化率达80%以上。
2008年,姚忠等(CN 101270376A,2008)利用具有γ-谷氨酰转肽酶活性 的枯草芽孢杆菌NX-2(CGMCC No.0833),催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶 氨酸,转化率达57.5%以上。
由于酶法合成L-茶氨酸与化学合成法相比不会产生消旋现象,而且转化率 较高,所以受到了广泛重视和研究,并已经进入工业化应用领域。
到目前为止,利用微生物来源或基因工程来源的γ-谷氨酰转肽酶作为催化 剂,以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺为底物,酶法制备L-茶氨酸的 方法还未见文献报导。
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