[发明专利]一种快速检测藻毒素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

一种快速检测藻毒素的纳米免疫磁珠层析试纸条及其制备方法，涉及藻毒素检测技术领域。

背景技术

随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库，使水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)的分布广、危害大更应引起重视，其是由某些种属的淡水蓝藻，主要是铜绿微囊藻产生的一个结构相似的环七肽家族，已知有60余种异构体。其结构如下：

其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。其中X和Y分别为Leu和Arg的最为常见、毒性也最大。基于此，世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0μg/L，我国现颁布执行的生活应用水水质卫生规范(2001)藻毒素为0.001mg/L、地表水环境质量标准(GB3838-2002)微囊藻毒素-LR为0.001mg/L。故对藻毒素准确有效监测尤为重要。

常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等，这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmuno-sorbent Assay，简称为ELISA)和胶体金免疫层析法(Colloidal GoldIrnmuno-Chromatography Assay，简称为GICA)由于其廉价，特异，灵敏和快速等特点，被广泛地使用于药物残留的快速筛查中。但ELISA试剂需要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，时间较长；胶体金类试剂操作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察会产生误差，亦不能记录。

纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。

此纳米免疫磁珠检测试纸基本原理如下：采用竞争法，即样品中的藻毒素MC-LR和固定在包被膜上的包被抗原MC-LR-OVA竞争磁珠标记的抗藻毒素多克隆抗体。

利用免疫磁珠标记一种抗体，在试纸的NC膜上包被相应的包被抗原和羊抗兔二抗。当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细管作用从下往上泳动，溶解磁标垫上干燥的磁标抗体，当待测样品中不存在待测药物，则磁标抗体会直接泳动到检测线(T线)和硝酸纤维膜上的包被原MC-LR-OVA发生免疫反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黑色的线条，然后其他未结合的磁标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线(C线)上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成黑色线条，这样包被膜上就会有两条黑色线条，表示样品为阴性。当待测样品中存在待测药品，则磁标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的磁标抗体有剩余时，才会在检测线上与MC-LR-OVA发生免疫反应，形成黑色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当磁标抗体全部和样品中的待测药品藻毒素MC-LR发生免疫结合时，就不会再有抗体与检测线包被原结合，从而检测线就不会有黑色线条出现。控制线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物藻毒素MC-LR，控制线都应该显现。如果控制线不显色，则说明试纸条失效。最后通过测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。和胶体金试纸类相比，免疫磁珠检测试纸最大的不同在于将标记胶体金改为标记磁珠，检测结果时用Magnetic Assay Reader对检测线上的磁珠含量进行检测并把磁信号转变为电信号，而不是依靠肉眼去总判定，这样可使得结果判定更为精确、灵敏、客观和便于记录保存。利用纳米免疫磁珠研制藻毒素抗体检测快速诊断试纸尚无报道。

发明内容

本发明的目的：针对现有检测藻毒素的技术的不足和缺陷，提供一种基于纳米磁珠免疫技术的、灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜的可快速检测藻毒素的检测方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测藻毒素的残留。