[发明专利]一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法

说明书

技术领域

一种提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。本发明涉及一种在T.glabrata内过量表达来源于L.lactis中编码形成水的NADH氧化酶nox基因。提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的水含量升高，保护细胞在高渗条件下的生长和功能。

背景技术

NADH氧化酶直接将NADH氧化成NAD⁺并将O₂还原成H₂O。研究结果表明这个酶的表达会导致NADH/NAD⁺的比例急剧下降，并显著的提高细胞对抗氧胁迫的能力。另外，NADH可以将O₂直接还原成水，不需要经过电子传递链，提高了形成水的效率，增加了胞内水含量，增强了细胞在高渗条件下的生长和功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过在光滑球拟酵母T.glabrata表达形成水的NADH氧化酶，显著降低了NADH/NAD⁺的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内水含量升高。在高渗条件下(3824mOsmol·kg^-1)T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高。

本发明的技术方案：一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法，利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因过量表达于CCTCC M202019中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U·mg^-1 protein的重组菌T.glabrataPDnoxE，在T.glabrata中表达nox基因，显著降低了NADH/NAD⁺的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高，在3824 mOsmol·kg^-1高渗条件下T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高，表明通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性，通过过量表达NADH氧化酶，保护光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫。

1、菌株

原菌(模式菌株)：光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M 202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(Pdx)四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为江南大学选育菌株，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142.2，公开号为CN1392246A。

工程菌：在光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M 202019细胞内过量表达来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因，构建工程菌T.glabrata PDnoxE。

2、培养基

种子和斜面培养基(g·L^-1)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O0.5；琼脂20(斜面培养基)，pH 5.5。

基本发酵培养基(L)：葡萄糖100g，NH₄SO₄ 7g，MgSO₄·7H₂O 0.8g，KH₂PO₄5g，CH₃COONa 5g，pH 5.0。

3、摇瓶培养：

将30℃、200rpm下培养24h的种子以10％的接种量分别转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养48h，按实验要求添加不同浓度的烟酸、维生素B₁、维生素B₆、生物素Bio。

细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。