[发明专利]一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法

说明书

技术领域

一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，涉及一种通 过同源重组构建基因突变文库的方法。属于蛋白质工程，分子生物学技术，基 因工程领域。

背景技术

酶的体外定向进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间 结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、 重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶 的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能 够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径， 并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。

酵母是表达外源基因的最重要的表达系统之一。酵母作为单细胞生物，在 生产和操作上具有细菌表达系统易于大规模扩增的特点，又具有真核细胞对蛋 白质的翻译后加工及修饰的作用。酵母表达系统的表达载体主要分为两种，即 整合型载体和附加型载体。整合型载体不含自主复制序列，转化入酵母后整合 到酵母宿主菌的染色体上，具有稳定性好的优点，尤其适合于工业化生产。而 附加型载体能够在酵母体内自主复制，达到较高的拷贝数，但是在非选择条件 下多不稳定。

易错PCR是在体外随机引入基因突变的一种基本方法，其原理是在PCR 过程中加入高浓度的Mg²⁺和Mn²⁺，利用不平衡的dNTP(脱氧核苷三磷酸)，以 提高Taq酶在PCR扩增过程中随机引入突变的概率(Kammann et al.，Nucleic Acids Res.1989，17(13)：5404)。传统易错PCR构建酵母外源基因整合型突变文 库的步骤一般包括：以目的基因作为模板进行易错PCR，得到含有随机突变的 扩增片段；用限制性内切酶对扩增片段和表达载体进行处理；用DNA连接酶将 二者连接；将重组表达载体导入大肠杆菌；培养大肠杆菌，大量扩增表达质粒； 提取质粒进行酶切线性化；转化酵母，最终获得带有各种不同突变基因的重组 细胞，即基因突变文库。这个过程步骤繁琐、效率低、耗时耗力，极大的损失 了突变基因的容量，而基因突变文库需要从成千上万个转化子中才能筛选到目 的转化子，因此传统方法不能满足构建酵母整合型基因突变文库的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效的基于体内同源重组构建酵母整合型基 因突变文库的方法。

本发明的技术方案：一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，基于体内 同源重组，其步骤为：

(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表 达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；

(2)以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游 与表达载体有20～70bp同源序列的突变基因；

(3)对表达载体的两个区域：①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因 组同源区域，进行酶切线性化；

(4)将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混 合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有 同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组 同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合 入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。

步骤(1)中所述的表达载体为整合型载体pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、 pPIC3.5、或pAO815。

构建基因突变文库的优选酵母宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕 赤酵母KM71。

本发明的原理如图1所示，以宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115、整合型表达 载体pPIC9K为例，外源基因用gene表示。

(1)以重组表达质粒pPIC9K-gene为模板，易错PCR扩增得到上下游与 表达载体有20～70bp同源区段a和b的突变基因；

(2)对表达载体pPIC9K酶切线性化：分为两步，一是酶切表达载体的需 插入外源片段处的酶切位点，二是酶切整合入酵母基因组的同源区段；