[发明专利]单胺氧化酶诊断试剂(盒)及单胺氧化酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

现有技术中，测定单胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有：荧光法、免疫抑制法和化学分光光度法。荧光法是以β-苯乙胺作为底物来检测单胺氧化酶，其依据是：β-苯乙胺在10～100mg时反应速度最大，高于苄胺和5-羟色胺的反应速度。免疫学方法则利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，测定反应后形成的单胺氧化酶同工酶，目前应用较多的单克隆抗体有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

相对而言，化学分光光度法应有更为普遍。可以用单胺氧化酶催化胺类释放出的过氧化氢(H₂O₂)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定，也可以应用苄胺(Benzylamine)、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又称“3-对羟基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等作为反应底物来测定单胺氧化酶的活性。其中，应用苯甲胺类型底物测得的单胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物测得的活性约为3-对羟基苯乙胺作底物的30％。目前，单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚作为底物。苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，这在生化仪上测定较困难；对苯甲胺-β-偶氮萘酚方法则需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂(盒)不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法如下：

胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+过氧化氢

过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A

+氧

辅酶A+丙酮酸+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A+

还原型辅酶

这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase；EC 1.4.3.4EC 1.4.3.6)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase(CoA-acetylating)；EC 1.2.3.6)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶酶解胺类化合物反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶诊断/测定试剂较为理想：

缓冲液                100mmol/L

稳定剂                500mmol/L

辅酶                  3mmol/L

丙酮酸氧化酶          12000U/L

丙酮酸脱氢酶          10000U/L

胺类化合物            5mmol/L

碳酸氢钠              12mmol/L

乙酰辅酶A             3mmol/L