[发明专利]异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。

背景技术

异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)的作用下变成α-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，EC4.1.3.1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。

中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D-异柠檬酸的测定方法-紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理：异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型：以NAD为辅酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP为辅酶的酶(EC1.1.1.42)，两者催化同一反应。

在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明异柠檬酸浓度测定方法如下：

异柠檬酸+辅酶  异柠檬酸脱氢酶  二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶

二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素b1  丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.2.2)丙酮酸

                                          +高铁细胞色素b1+水

丙酮酸+辅酶A+辅酶  丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)二氧化碳+

                                 乙酰辅酶A+还原型辅酶

这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC1.1.1.42)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.2.2)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应比色终点法。异柠檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶(EC1.2.2.2)、丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想：

缓冲液                       100mmol/L

稳定剂                       500mmol/L

辅酶                         3mmol/L

异柠檬酸脱氢酶               10000U/L

丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.2.2)     12000U/L

丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)    12000U/L

乙酸                         7mmol/L