[发明专利]废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法

权利要求书

1.一种废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法，其特征在于， 具体步骤如下：

①收集废水生物处理反应器中微生物样品进行预处理，利用苯酚-氯仿法提取基因 组总DNA；

②使用16S rDNAV3区引物341F-GC和518R、344F-GC和518R对样品DNA进行PCR 扩增；

③利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物；

④得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析，并根据切胶测序特征DGGE条带， 对所代表的微生物进行鉴定；

⑤根据条带所代表的微生物种类来设计构建变性梯度凝胶电泳数据库DGGE Marker作为快速分子检测的对照标准；所述变性梯度凝胶电泳集合库DGGE Marker是 根据PCR产物经变性梯度凝胶电泳DGGE分离后的条带通过切胶克隆测序然后在 Genbank中同源比对明确其代表的微生物种类来设计构建的；直接采用已知条带的PCR 产物混合或者将已知条带所对应的纯培养物DNA进行PCR扩增产物混合，从而作为 快速分子检测方法的对照标准；所述生物样品为废水生物处理反应器中活性污泥；包 括厌氧颗粒污泥、好氧颗粒污泥和生物膜样品，且经过冷冻干燥和液氮研磨的预处理， 再提取基因组总DNA；上述步骤①、②中，所述DNA由细菌和古菌的16S rDNA V3 区片段设计正向引物5′连接至GC-夹板进行PCR扩增；所述16S rDNA V3区片段进行 PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min 共30个循环，最后72℃延伸10min；利用变性梯度凝胶电泳DGGE分析所述PCR扩 增产物的条件为：制备随变性剂尿素浓度梯度45%-70%，同时增加丙烯酰胺凝胶浓度 梯度8%-10%形成双梯度-变性梯度凝胶电泳DG-DGGE，电泳电压80V，电泳时间15h， 二溴乙锭染色20min，脱色20min；

步骤①中，DNA提取的步骤是：微生物样品经溶菌酶处理和SDS裂解：将50mg 研钵加入液氮研磨直至粉末状沉淀悬浮在1.5ml 0.1M Tris-HCl，0.1M Na₂EDTA，0.1M  NaCl构成的DNA提取液、pH8，并加入10mg/ml的150μL溶菌酶溶液；37℃温浴 1h后，向菌液中加入0.5ml 10%SDS溶液，并漩涡振荡摇匀，65℃温浴30min，每 间隔几分钟摇匀，待菌液变清后离心10min，得到DNA上清液并取DNA上清液置于 冰上留用；重复以上步骤一次，收集所述两步骤得到的DNA上清液；用等体积的苯酚 +氯仿+异戊醇、体积比为25:24:1和氯仿+异戊醇、体积比为24:1各抽提1次，离心并 空气干燥至DNA沉淀干燥后，溶于100μL TE缓冲液中。