[发明专利]乳糖诊断/测定试剂(盒)及乳糖浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。

牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影响。很多人在饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良或乳糖酶缺乏。

据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为95％-100％。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3-13岁儿童乳糖不耐受症和乳糖吸收不良的发生率约为80％。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑发育，对人体健康危害很大。

在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明乳糖浓度测定方法如下：

乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖

半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖己糖双醛糖+过氧化氢

过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+2水

这种方法应用乳糖酶(lactase；EC 3.2.1.108)酶(偶)联半乳糖氧化酶(GalatoseOxidase；EC 1.1.3.9)、NADH过氧化物酶(NADH peroxidase；EC 1.11.1.1；EC1.11.1.2)酶促反应比色终点法。乳糖酶酶解乳糖反应产生半乳糖，再通过(偶)联合半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算乳糖的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想：

缓冲液                              100mmol/L

稳定剂                              500mmol/L

辅酶                                3mmol/L

乳糖酶                              10000U/L

半乳糖氧化酶                        12000U/L

NADH过氧化物酶                      12000U/L

本发明的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶。

试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1