[发明专利]一种匍匐型地被菊遗传转化的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，专用于匍匐型地被菊分子育种工作，属于菊花分子育种领域。

二、背景技术

地被菊是一类同时具备绿化、美化、彩化和香化综合功能的独特地被植物，株型低矮或匍匐，但匍匐型品种目前还奇缺，其推广应用前景极为广阔，倍受园林部门关注。因而筛选、培育具有优良性状的匍匐型地被菊新品种有着巨大的实用价值和经济意义。

近年来，随着植物基因工程的发展，分子育种克服了常规育种的种种限制，为利用新的基因资源改良菊花品种提供了新的手段和途径。农杆菌介导法以其易操作、低费用、高效率、插入DNA片段大、稳定性好、转基因拷贝数低等优点，成为转基因策略中的首选方法。自Lemieux利用农杆菌介导法诞生第1株转基因菊花以来，农杆菌介导的遗传转化技术已经在菊花遗传转化方面获得了成功。但菊花转基因还存在对基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，因此，针对不同类型菊花品种建立遗传转化体系，已成为大范围菊花分子育种首要解决的问题。

匍匐型地被菊的遗传转化研究至今未见报道，因此，系统深入研究其遗传转化条件，建立专门针对匍匐型地被菊的遗传转化体系，可为地被菊分子育种工作提供理论基础和实验依据，有效推进匍匐型地被菊分子育种进程。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是针对根癌农杆菌介导的菊花转基因存在的基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，专门对匍匐型地被菊的遗传转化条件进行了系统深入研究，建立了一套适用于匍匐型地被菊的遗传转化体系，为匍匐型地被菊分子育种奠定基础。

技术方案

一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，包括：

1)无菌苗的获得

于秋末取匍匐型地被菊脚芽，洗涤剂清洗15min，流水冲洗2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用体积比为70％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至2cm左右时切下转入生根培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1获得无菌苗；

2)农杆菌悬浮液制备

菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化

①DREBa基因克隆与连接

以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板进行RT-PCR(Reverse transcription PCR，以RNA为模板反转录合成双链cDNA的PCR)扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF(Open Reading Frame)，扩增引物如下(下划线部分为酶切位点，BamH I和Kpn I分别为酶切正向引物和反向引物的内切酶)：

BamH I

正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’

Kpn I

反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’

用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体(T-easy Vector)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg·L^-1氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5α转化

用BamH I和Kpn I双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；

③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定