[发明专利]一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物

说明书

技术领域

本发明涉及基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微卫星引物，可应用于三疣梭子蟹的种质鉴定与评价和遗传结构分析的微卫星引物。

背景技术

三疣梭子蟹(P.trituberculatus)，俗称海蟹或大蟹，属于甲壳纲，十足目，梭子蟹科。它广泛分布在中国南北沿海，是中国大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源，开展三疣梭子蟹群体遗传结构分析和种质鉴定工作，对于三疣梭子蟹的增养殖亲本选择和原种、家系和优良品种资源保护具有重要的应用价值。

目前常用来进行评价生物遗传多样性和种质鉴定的分子标记均具有一定程度的缺陷，如RAPD技术(随机扩增序列多态性DNA，Random amplifiedpolymorphic DNA)，常因RAPD引物过短10个碱基、退火温度过低一般36-37℃，导致扩增产物的一些非特异结果，其可靠程度和真实性是主要的缺陷；而AFLP技术(扩增片段长度多态性，Amplifiedfragment lengthpolymorphism)，又因操作条件复杂如要求酶切、成本相对较高而限制了其广泛的应用。微卫星标记是一种新兴的分子标记技术，实质就是基因组中大量存在的串联重复序列，以这些重复序列作为遗传标记可以进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建等一系列工作，其工作原理是通过已知的基因序列寻找微卫星序列然后在微卫星序列上下游设计特异性引物，这样设计的引物就成为微卫星引物，通过使用设计好的成对引物就可以通过PCR技术扩增出微卫星标记带，通过电泳凝胶成像技术成像后进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析或遗传连锁图谱的构建。应用微卫星引物扩增出的微卫星序列电泳分离时具有单碱基的高分辨率，遗传信息量大，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有很高的稳定性和多态性，且DNA用量较AFLP少，技术要求低，微卫星标记技术则正好克服了RAPD和AFLP技术的这些缺点，具有很好的应用价值。

线粒体DNA为细胞核外遗传物质，且以母性遗传为主，具有结构简单、碱基突变率高、核苷酸歧义度大和进化速度快等特点，特别适宜种质鉴定和遗传结构分析。D-LOOP俗称D环，又称线粒体控制区，具有较高的变异水平，特别适合于种以下水平的遗传分析和亲缘关系鉴定，目前，D-LOOP作为分子标记在种质资源评价和群体结构分析中被认为是最广泛的基因之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，开发一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物，该引物可克服现有技术引物过短，退火温度低，操作条件复杂，成本高、准确性低的缺陷。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物，其特点是，所述的微卫星引物为：

D-LOOP78DY1： F：AAGGCCTACATACAAAGAGC

              R：ACTAAGTGAAGAATGAGATA

D-LOOP91DY4： F：TATATCTAATTCTTCACTT

              R：AACTATCTAATTACTGTCTT

D-LOOP125DY4：F：CAAAACTAATTCCTATAAACTAAA

              R：AACCAAAGCATTCCCTGAG

D-LOOP52L2：  F：TTTGAGAATAAGATGATAGG

              R：AACGGGAGAATAAGATGAAA

D-LOOP229L13：F：TGGAGTTCCTATTTCATCTTATT

              R：TCACTTTCTTCCTTTGCTCAT

D-LOOP150DY2：F：TTTCTTCCTTTACTCATTA

              R：CTATTTCATCTTATTCTGTCGTT

D-LOOP135DY2：F：TACTAGTATATCGTTTA

              R：ATTTTGTATATTTAGGTG

D-LOOP225DY2：F：TCGTTTTATTGATTATT

              R：AAAAAGTTGAAAGAGTA

上述微卫星引物可通过以下方法得到，

(1)采集三疣梭子蟹活体运回实验室提取总DNA，通过PCR扩增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，将PCR产物进行双向测序；