[发明专利]青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程应用

权利要求书

1、青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程应用，包括：

1)popW基因的克隆

青枯菌ZJ3721在30℃条件下培养于MBG培养基，待菌株生长到对数期，按照细菌基因组提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA；

设计扩增popW基因引物popW1：

上游引物F：CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC   Nde I

下游引物R：GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG  Hind III

或扩增popW基因引物popW2：

上游引物F：ATG TCC ATC CAGATTGATCGC

下游引物R：GCCCGAGTAGGCCTTGTAG

或扩增popW基因引物popW3：

上游引物F：TCTAGAATGTCCATCCAGATTGATCGC  Xba I

下游引物R：GGATCCGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT  BamH I

以基因组DNA为模板，使用高保真pfu聚合酶扩增PopW的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃ 10min，产物切胶回收；

2)PopW蛋白的表达及纯化

产物切胶回收后加A后连接至中间载体酶切或直接酶切后连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体，测序鉴定，得到重组质粒pET-popW，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，将筛选到的阳性克隆接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃，180转/分条件下培养过夜，第二天按1:100的比例接种到10mL LB中，按照上述条件培养3个小时，然后加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM，诱导培养2个小时后，在4℃下，6000转离心10分钟收集菌体，将其悬浮于20mMTris-HCl、pH8.0，加入终浓度为1mM的苯甲基磺酰氟，然后超声波破碎仪上进行菌体破碎，当菌液变澄清时，离心吸取上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测，并用镍柱纯化PopW蛋白，具体操作参照High-Affinity Ni-IDA Resin操作说明书进行，获得纯化PopW蛋白。

2、根据权利要求1青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程应用，其特征在于，获得的纯化PopW蛋白在植物抗病性方面的应用。