[发明专利]具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法

说明书

技术领域

具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体地说本发明是利用蛋白质工程的定点突变方法改善环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)的产物特异性的技术。 

背景技术

环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-环糊精，它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。 

CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基化反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。用CGT酶生产环糊精一个主要的不利条件是所有已知的野生型CGT酶生产的是α-、β-、γ-环糊精的混合物。这不仅给产物的分离纯化带来很大不便，而且提高了成本。 

本发明主要是对来源于软化类芽孢杆菌Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶进行了产物特异性的定点突变改造。 

发明内容

本发明的目的是提供提高P.macerans JFB 05-01 CGT酶产β-环糊精能力的突变方案。 

本发明的再一个目的是提出具有更高β-环糊精生产能力的突变体酶K47R，K47H，K47T，及其构建方法。 

本发明的技术方案：来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶，简称CGT酶，的三种突变体酶K47R，K47H及K47T，将CGT酶基因中第47位的赖氨酸Lys分别变成了精氨酸Arg，组氨酸His或苏氨酸Thr，分别命名为K47R，K47H及K47T，它们相比于野生型CGT酶具有更高的产β-环糊精能力。 

软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01(CCTCC NO：M208063)，已在中国专利CN101294149A公开，公开日2008年10月29日。 

所述的三种突变体酶K47R，K47H及K47T的制备方法，根据P.maceransJFB 05-01 CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Arg47，His47，Thr47密码子的定点突变引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出Lys47密码子变成Arg47密码子，His47密码子及Thr47密码子的突变体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。 

(1)定点突变 

利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板进行定点突变， 

引入Arg47密码子的定点突变引物为： 

正向引物：5’-CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)， 

反向引物：5’-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)， 

引入His47密码子的定点突变引物为： 

正向引物：5’-CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)， 

反向引物：5’-CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)， 

引入Thr47密码子的定点突变引物为： 

正向引物：5’-CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3’(下划线为突变碱基)， 

反向引物：5’-CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3’(下划线为突变碱基)，