[发明专利]产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ IDNO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。

2.一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。

3.根据权利要求2所述的制备转化体的方法，其特征在于所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。

4.根据权利要求3所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为：利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体pHY300PLK中扩增出如SEQ ID NO.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因Tet^R，将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH--Tet^R，重组质粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。

5.根据权利要求4所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为：

(1)基因aldH的克隆：根据Genebank公布的醋酸杆菌中aldH基因的序列设计合成PCR所需的引物：

P1：5¹-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-3¹

P2：5¹-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-3¹

引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD 18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；

(2)基因Tet^R的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：

P3：5¹-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-3¹

P4：5¹-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-3¹

引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min20 sec30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，Hind III酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH-Tet^R；

(3)转化微生物的获得：将重组质粒pUC18-aldH-Tet^R通过电击转化的方式转化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重组肺炎克雷伯氏菌。

6.权利要求1所述含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，其特征在于生产工艺为：

(1)种子液的培养：将接种后的培养液在31-37℃，摇床转速120-180r/min的条件下培养12-24h；所述培养液组成为：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；

(2)发酵培养：培养条件为接种种子液的量为占培养基体积5-10％，发酵温度31-37℃，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境，发酵时间30h左右；其中培养基组成为：酵母膏4-5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8-10g/L，KH₂PO₄ 1.5-2.5g/L，NH₄Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.08-0.12g/L，FeCl₃·6H₂O 25-35mg/L，CoCl₂·6H₂O 4-6mg/L，VitaminB₁₂ 5mg/L，glycerol 30g/L。