[发明专利]一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法

权利要求书

1、一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是首先构建重组质粒pP_glaA-Hyg^R；将重组质粒pP_glaA-Hyg^R经Hind III线性化后转化黑曲霉F0410原生质体；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，命名为CICIM GAH14；对CICIMGAH14进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株；步骤如下：

(1)根据黑曲霉F0410的糖化酶基因启动子的DNA序列SEQ ID NO：1设计引物，以含有糖化酶基因启动子的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得到糖化酶基因启动子；

(2)将克隆载体pBlueScript SK(-)经SmaI限制酶作用后，与步骤(1)的糖化酶基因启动子在T4连接酶的作用下反应过夜，得到连接产物；

(3)将步骤(2)的连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pSK-P_glaA；

(4)将步骤(3)所得的重组质粒pSK-P_glaA和质粒pRS303H分别经BamHI、NcoI双酶切后，胶回收813bp的P_glaA片段和5108bp的载体片段，用T4连接酶连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pRS-P_glaA；

(5)将pRS303H采用NcoI单酶切，胶回收357bp无启动子的hphNT1基因，并将其插入pRS-P_glaA的NcoI位点中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pP_glaA-Hyg^R；

(6)将步骤(5)所得的重组质粒pP_glaA-Hyg^R经HindIII线性化后，以原生质体转化方法转化宿主细胞黑曲霉F0410，用100～200μg/mL潮霉素筛选出转化子，阳性转化子即为CICIM GAH14；

(7)对CICIM GAH14进行传统物理诱变；

(8)再用潮霉素进行突变株的筛选，在含200～2000μg/mL潮霉素的抗性平板中进行突变株的筛选，获取高产糖化酶工业生产菌株，正突变率达到37.5％，而正突变的菌株产糖化酶水平比黑曲霉F0410提高8％～58.7％。