[发明专利]抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用

说明书

技术领域

抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

β-catenin是一种新的原癌基因产物，也是细胞内十分重要的信号分子，它在肿瘤病因研究领域中有重要作用。β-catenin的相对分子质量约为92000，其编码基因定位于人类染色体3p21。它的功能参与钙黏蛋白介导的细胞间黏附，并且作为Wnt信号通路的重要成员参与细胞增殖、分化的调节，是近年来大肠癌研究领域的热点。然而，用于临床的β-catenin抗体国内生产很少，为了能够提供质优、价廉的β-catenin抗体，我们应用美国MD公司制备的小鼠重组β-catenin蛋白制备了抗β-catenin单克隆抗体，并分析了β-catenin蛋白在人结肠癌细胞株以及在结肠良、恶性肿瘤组织中的表达情况。从实验结果来看，本发明制备的抗体具有效价高，特异性强等特点，可用于科研或临床诊断结肠癌。

发明内容

本发明的目的是提供抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用，为β-catenin蛋白的表达、肿瘤病因研究提供有价值的物质条件。

本发明的技术方案：一种抗β-catenin单克隆抗体的制备方法，应用重组小鼠β—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA双筛得到1株抗β-catenin单抗1D3，其亚型为IgG2a；步骤为：

将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养液选择培养10天，6块96孔板中500孔有杂交瘤细胞生长，融合率为90％；融合后第12天，进行第1次ELISA双筛选，先将吸出的上清分别与融合蛋白β-catenin和P21包被的抗原板行EL1SA检测，选择β-catenin为阳性而P21为阴性的克隆进行第一次亚克隆，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3-4次，最后获得1株能稳定分泌抗β-catenin McAb的杂交瘤细胞株，命名1D3，亚类鉴定为IgG2a。

抗β-catenin单克隆抗体在结肠癌病理检测中的应用：

用免疫印迹法Western blot检测β-catenin抗体的纯度和特异性以及结肠癌细胞系SW48和HCT116中β-catenin蛋白的表达；用免疫组化SP法检测β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织中的不同表达；结果显示：

(1)抗β-catenin抗体特异结合β-catenin重组蛋白

β-catenin重组蛋白经8％的SDS-PAGE电泳，将凝胶中的β-catenin转移至PVDF膜上，封闭后，用抗β-catenin抗体进行免疫染色，加入制备并纯化的β-catenin抗体，工作浓度1∶2000，4℃过夜，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1∶5000，于37℃反应1h，出现Mr为92000的条带，与文献报道相符，证明此抗体为抗β-catenin的特异性抗体；

(2)抗β-catenin抗体在结肠癌细胞株中的应用

从人结肠癌细胞株SW48和HCT116中分别提取细胞总蛋白，用制备的抗β-catenin抗体做免疫印迹检测，得到两条特异性条带，说明这两种结肠癌细胞株均为β-catenin蛋白表达；

(3)β-catenin在结肠癌组织中的表达

应用抗β-catenin抗体对正常结肠和结肠癌β-catenin的表达进行定位分析，按常规法作病理切片进行免疫组化染色，一抗为兔抗β-catenin，稀释度为1∶100，并用PBS替代一抗作为空白对照，DAB显色，苏木精复染，结果显示，β-catenin在正常结肠组织中表达在细胞膜上，而在结肠癌组织中有52.17％为阳性表达，并且发现β-catenin在细胞浆中大量表达，提示结肠癌发生后β-catenin由细胞膜易位入细胞浆。