[发明专利]靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤的基因治疗，具体涉及一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，属基因工程技术领域。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的顽症之一，尽管除了手术、放疗和化疗，还有导向治疗、肿瘤疫苗和基因治疗等多种新的疗法，但目前效果仍不尽人意。众所周知，人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机能捕获和消灭机体内新生的肿瘤细胞。而引起肿瘤发生的最终因素都可以归结为机体免疫效应细胞在数量和质量上不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，从治疗上讲，有效的抗肿瘤策略：(1)增强机体抗肿瘤免疫反应，主要是提高肿瘤局部活化的免疫效应细胞的数量，其中主要组织相容性复合物(MHC)限制性的细胞毒T细胞(CTL/Tc，即杀伤性T细胞)是最重要的免疫监视和效应细胞。(2)采取有效手段直接杀死肿瘤细胞。

超抗原(Superantigen，SAg)是一组细菌或病毒编码的蛋白质分子，可不需要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)提呈作用，以完整的蛋白质分子形式直接与APC膜的MHC-II类分子抗原结合槽外侧结合并且提呈给T细胞。SAg-MHC-II类分子复合物仅与TCR(T细胞抗原受体)β链的V区相结合，由于人类V_β基因有20余种，故SAg激活的T细胞克隆数可达普通抗原的数千倍乃至数万倍。超抗原的抗肿瘤作用主要是由SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用来完成(Superantigen-dependented cellular totoxicity，SDCC)，这是超抗原抗肿瘤的主要作用。再者，SAg激活的CD⁴⁺T细胞还可以分泌多种足量的细胞因子如：TNF-α、TNF-β和INF-γ、IL-2、IL-6等，直接或间接地杀伤肿瘤细胞。超抗原作为一种新型的抗肿瘤治疗模式，近年来研究进展很快，主要集中在超抗原直接抗肿瘤作用、超抗原靶向抗肿瘤作用、以及超抗原的基因治疗等方面；目前最有效的是已进入II期临床试验用于晚期肾癌的5T4Fab-SEA靶向超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphyloccollal enterotoxin，SEA)是目前研究最多的超抗原。但是无论是单用超抗原进行抗肿瘤治疗还是目前抗体靶向的超抗原抗肿瘤治疗，都还有很多需要克服的困难：单用SAg治疗的缺陷也是非常明显的，即SAg介导的CTL主要杀伤MHC-II阳性的肿瘤细胞，对MHC-II阴性的肿瘤细胞杀伤作用较弱，但肿瘤细胞MHC-II阳性率一般都很低，并具有明显的异质性，因此，单纯的SAg抗肿瘤的效果不理想，且难以避免对机体MHC-II阳性的正常细胞造成的毒副作用。而单抗与超抗原的融合蛋白活化的T细胞是SEA反应性的，并不是肿瘤特异性的T细胞。故此类超抗原-单克隆抗体的融合蛋白尚缺乏抗瘤的广谱性和特异性，其诱导的靶向抗肿瘤免疫应答并不尽如人意。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，该技术能够利用病毒自身的裂解能力杀死肿瘤细胞，同时病毒的复制产生子代病毒导致级连放大效应，在肿瘤间自行扩散，达到最终消活全部肿瘤的效果。更关键的是，它能选择性在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有影响，这使其在保证治疗率的同时保证了安全性。因此，肿瘤特异性增殖病毒是一种具有抗肿瘤作用的特殊病毒性基因治疗载体。我们以肿瘤特异性增殖腺病毒质粒为载体，携带超抗原SEA基因片段，并进一步与病毒骨架质粒重组包装成溶瘤腺病毒-超抗原复合物，该复合物将既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对肿瘤细胞产生强大的靶向治疗效。

本发明是以如下技术方案实现的：一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，其特征是：它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段。

所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，且SEA基因片段的长度为771bp。

所述的靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征是按如下步骤进行：