[发明专利]一种柠檬黄完全抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种柠檬黄的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

柠檬黄色素(Tar)是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，其分子结 构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的-芳香类化合物。 因此，我国对在食品中的柠檬黄色素有严格限制。凡是肉类及其加工品，鱼类 及其加工品等都不能使用人工合成色素，即使在适用的品种和范围内，使用剂 量也有严格规定，决不允许过量使用。但实际上，我国食品中普遍存在柠檬黄 色素的超标、超范围使用现象屡禁不止。如果人们长期或一次性大量食用柠檬 黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏 负荷时会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，检测柠檬黄含量采 取的方法是薄层分析及分光光度法，近年来，我国科研工作者在柠檬黄检测方 面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，这些方法不仅需要昂贵的 仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本 前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年 来，国内外已经开展了对色素类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对柠 檬黄的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备柠檬黄完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种柠檬黄完全抗原的合成方法。所制备的产品用于 柠檬黄的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种柠檬黄完全抗原的合成方法，以柠檬黄为半抗原， 用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比； 步骤为：

(1)柠檬黄完全抗原的合成：

配制A液：取53.4mg(0.1mmol)柠檬黄溶于2mL二甲亚砜(DMSO)中， 冰浴10min，加入51μL三正丁胺，冰浴10min，加入87μL氯甲酸异丁酯，4℃ 下，搅拌孵育1h，为A液，4℃保存备用；

配制B液：130mg(0.002mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液，为B液，4℃保存备用；

冰浴条件下把A液逐滴滴加入B液中，边加边摇，于4℃下孵育4h，即得柠 檬黄完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离 子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

透析：将柠檬黄完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的 pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透 析袋中的液体制成粉末，即得到柠檬黄完全抗原；

(2)柠檬黄完全抗原的鉴定：柠檬黄完全抗原采用分光光度法鉴定其偶 联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的 蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定柠檬黄完全抗原的偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方 法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓 度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联 物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸光系数ε：配制柠檬黄浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的0.01M的PBS 溶液，通过紫外扫描可知柠檬黄的最大吸收波长为427nm，在427nm处测吸光 值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。