[发明专利]一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a9的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的30～40％，而且正以每年大于1％的速度增加，以儿童患者的发病率上升最为明显。我国近年来对全国的大规模调查显示，儿童哮喘发病率比10年前明显增加，仅小儿哮喘患者达1000万之多，其中过敏为主要诱因(全国哮喘儿童防治协作组2003)。此外，与癌症和心脑血管疾病不同，哮喘对人类社会和经济的影响是不能简单地以其死亡率来衡量的，而要从这种疾病的发作频度来衡量其给人类造成的经济负担。由于哮喘多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，在我国，北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8～43.8％。哮喘发病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前常见的美洲大蠊和德国小蠊过敏原已经被鉴定出来，包括3种美洲大蠊过敏原和7种德国小蠊过敏原被鉴定出来。目前，治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症状。有以下方法：1.利用抗组胺类以及类固醇药物以缓解症状，但是这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经常带来副作用。2.采用特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定，其原理是：通过反复给药诱导患者对此过敏原产生耐受性，当患者再次接触此类过敏原时，过敏反应就会减轻或是不产生反应。然而，用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源含有大量与过敏原无关的成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原，因此疗效不佳。3.利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要过敏原含量进行鉴定，在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展，其不利因素是：对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者都必须接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗，会导致副作用的产生，就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。4.采用生物化学分离和纯化技术的方法得到单独的过敏原。尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原。因为纯化工艺复杂，其过程极其耗费人力，并且在通常情况下，从昂贵的自然资源中纯化出过敏原产量都很低。基于上述原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此以外，使用重组DNA技术可以表达抗原表位片断或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。目前，利用重组DNA技术生产过敏原Per a 9蛋白只是在大肠杆菌中被表达，并没有在其他系统表达的报道，且在大肠杆菌中被表达的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性不高。

发明内容

本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白的方法，解决天然过敏原Per a 9蛋白纯化工艺复杂、特异性IgE结合活性不高的问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其步骤包括：

(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；

(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT进行PCR反应，获得美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的编码基因；

(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；

(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。

在上述生产方法中，所述步骤(2)中PCR反应条件为94℃预变性10分钟后，94℃30秒变性、50℃45秒退火、72℃1分钟延伸，进行35个循环。

所述Per a 9蛋白的编码基因如SEQ ID No：1所示。