[发明专利]氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法

权利要求书

1、一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，在28～32℃下振荡1.5～4h，制备原生质体，采用0.02％～0.3％浓度的氯化锂作为诱变剂，加入到再生培养基中，诱变灵芝原生质体，经再生培养、摇瓶深层发酵获得胞外多糖发酵液，用醇沉法提取多糖，苯酚-硫酸法测定多糖含量。

2、根据权利要求1所述的一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，所述复合酶液为溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶。

3、一种制备权利要求1所述的氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的方法，其特征是：按如下步骤进行：

(1)菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基上活化1～2次，取菌块接种于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，27～29℃进行摇瓶培养4～5天。

(2)取液体培养的菌丝，过滤收集菌丝球，用无菌水冲洗2～3次，再用甘露醇冲洗2～3次，转入巯基乙醇中，恒温摇床振荡30～60min，过滤收集菌丝球，用甘露醇冲洗2～3次，离心分离取沉淀为菌丝体，取菌丝体以1∶10～20的比例加入复合酶液，恒温下振荡酶解2～4h，过滤后滤液于500～1000r/min离心3～5min，取上清液于3000～4000r/min，离心5～10min，沉淀即为原生质体，用甘露醇冲洗并用甘露醇把原生质体稀释10倍。

(3)将0.02％～0.3％浓度的氯化锂添加到再生培养基中，取稀释后的原生质体涂布在再生培养基上，恒温培养6～8天。

(4)将再生菌落接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，恒温下培养6～7天得第一代诱变菌株，将其接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养6～7天得第二代诱变菌株，并接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养得第三代诱变菌株，接种第二代、第三代菌块于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，恒温摇床培养。

(5)取发酵液过滤后离心取上清液，80～90℃水浴浓缩成原体积的0.2～0.25倍，加入4～5倍体积95％乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞外粗多糖。

(6)将粗多糖稀释10～1000倍，测定吸光度，根据标准曲线求出多糖含量。