[发明专利]一种硅胶膜型DNA快速提取及保存的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用硅胶膜从细菌或者体液中提取及 保存DNA的一种方法。

背景技术

目前，从细菌或者体液中提取DNA的技术已经被广泛应用，提取和保存DNA 的方法也多种多样。

传统的DNA提取方法是酚氯仿法，该方法廉价，应用范围广，但是由于大 量使用有机溶剂容易引起环境污染。利用树脂、硅胶和硅胶膜吸附DNA特性而 研发的DNA提取试剂盒，环境污染小，但是操作步骤繁琐，需要裂解液裂解细 胞后通过多步离心获得纯化的DNA，成本较高并且采用上述方法均不能长期保存 DNA。

DNA保存目前普遍采用的技术仍然是低温贮藏，利用低温抑制核酸内切酶对 DNA的降解。采用该方法需要低温冰箱，保存条件要求高，同时也不利于DNA的 运输。

DNA在水溶液中呈酸性，带负电荷，硅胶膜表面的硅-氧键水化形成的硅烷 醇基团也呈弱酸性，带负电，因此两者之间会产生静电排斥不能互相结合。当 溶液中存在一定浓度的阳离子后，通过形成阳离子桥中和DNA和硅烷醇基团之 间的表面负电荷，从而使DNA的磷酸基团与硅烷醇基团之间形成氢键，使DNA 牢固的吸附在硅胶膜表面。同时与硅胶膜结合的DNA抵抗核酸内切酶降解的能 力比溶液中的DNA强100倍。盐浓度是影响DNA与硅胶膜结合的重要因素，DNA 与硅胶膜结合能力与盐浓度呈正比。PH值直接影响DNA磷酸基团与硅胶膜的带 电性，是氢键形成的基础，PH值在5-7之间，有利于DNA的吸附。当PH值超过 7，通过氢键吸附DNA的能力开始降低。因此高盐、低PH值条件下硅胶膜特异 性吸附DNA，反之当处于低盐或水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅烷醇基团与 DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。

DNA的提取和保存主要有以下几种途径：一：现场采集菌液或者体液，立 即提取DNA并低温保存。二：现场采集样本，低温冻存防止核酸酶降解，然后 运送至实验室提取DNA后低温冻存。采用方法一的缺陷是采集现场需要离心机、 超净工作台等实验室设备，对于野外采集样本或者不具备实验室条件的场所无 法使用该方法提取和保存DNA。采用方法二的缺陷是菌液或者体液低温运输不方 便，如果不需立即提取DNA，样本必须一直低温贮藏，成本较高。

因此研发一种既能快速提取DNA又能保存DNA的方法非常必要。

发明内容

本发明目的是通过对硅胶膜进行处理后，使样本DNA直接吸附在硅胶膜上， 同时抑制核酸内切酶的活性，从而可以长期保存DNA；通过洗脱吸附DNA的硅胶 膜，可快速获得纯化的DNA。

本方法利用上述的硅胶膜结合DNA原理，保存DNA采用如下步骤：(1)配 制由Tris-HCL、EDTA、SDS、异硫氰酸胍组成的裂解缓冲液，将PH值调制5.0-7.0； (2)将硅胶膜浸泡在裂解缓冲液中，使硅胶膜充分吸收缓冲液；(3)将硅胶膜 放置再洁净环境下晾干或者烘干；(4)将菌液或者体液滴在制备的硅胶膜上； (5)将上述吸附DNA的硅胶膜常温保存即可。

从吸附DNA的硅胶膜洗脱DNA采用如下步骤：(1)将上述吸附DNA的硅胶 膜放置在洗脱液I中洗涤后离心，吸弃洗脱液I；(2)重复步骤(1)；(3)通过 离心后干燥方式去除洗脱液I；(4)加入洗脱液II，离心后获得含有纯化DNA 的溶液，可用于后续PCR、酶切、转化等反应。

本发明通过将硅胶膜经过裂解缓冲液浸泡后，在高盐、低PH值的条件下 使硅胶膜具有裂解细胞释放DNA、吸附DNA、抑制核酸内切酶活性这三种特性， 从而使滴在硅胶膜上的菌液或者体液的DNA释放并吸附在硅胶膜的硅烷醇基团 上，并且由于硅胶膜结合的DNA抵抗核酸内切酶降解的能力增强以及核酸酶抑 制剂的存在，使DNA能长期室温保存。洗脱DNA时，将吸附DNA的硅胶膜放入 含有乙醇有机溶剂的洗脱液I中反复洗涤，使硅胶膜上的盐分以及蛋白质溶解 于洗脱液中而硅胶膜硅烷醇基团与DNA磷酸基团之间的氢键并不会被破坏。通 过离心后干燥的方式去除洗脱液I，避免对后续分子生物学实验操作产生影响。 加入洗脱液II，在低盐或者水溶液状态下硅胶膜释放DNA进入洗脱液II中。