[发明专利]利用2-5A合成酶和RNase L基因提高水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性

说明书

技术领域

本发明提供了一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻条纹叶枯病抗性提高的品种的新方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus，RSV)于1902年首次在日本分离获得，现广泛分布于中国、朝鲜、日本及前苏联东部各国，在田间引起水稻条纹叶枯病。RSV主要侵染禾本科植物，通过灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)以持久性方式传播，在寄主植物和介体昆虫中均能复制，并可由灰飞虱带毒雌虫经卵以较高比例传播给后代。近五年来水稻条纹叶枯病在江苏各水稻产区爆发流行，发病面积均在1000万亩以上，2004年更是出现了特大爆发，全省共有42个县发生水稻条纹叶枯病，波及面积达2320万亩，全省单季水稻损失在5亿斤以上，造成了粮食减产、农民减收，给农业生产带来了巨大的损失，同时也严重挫伤了农民的种粮积极性。由于迄今为止几乎没有能有效地从感染病毒的植株上除去病毒的化学药剂，而治虫防病的应急防治措施也无法作为一项长期的策略加以应用，这些原因进一步加大了病害的防治难度。国外的防治经验表明，利用品种自身的抗病性是防治病毒病最经济有效的措施，可是生产上目前使用的抗病品种抗性基因的来源多为巴基斯坦的水稻品种Modan，而随着病害的连年趋重发生，病毒亦存在进化变异进而克服上述抗病基因的可能性。因此有必要发掘和创制新的抗性资源，为水稻条纹叶枯病的可持续综合防控提供材料上的储备。

植物抗病毒转基因工程策略是通过导入一些植物外源的抗病毒基因来提高品种对病毒的抗性，一般分为以病毒基因组介导的抗性、以动物干扰素介导的抗性和以毒蛋白介导的抗性等几种。而其中以动物干扰素介导的抗性由于具有广谱抗性和环境友好等特点备受关注。动物的干扰素(Interferon，INF)是动物细胞在病毒或其它诱生剂作用下产生的，具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系。目前已见报道的主要为2’-5’寡腺苷酸酶系统(2-5A系统)，该系统在病毒dsRNA的作用下激活2-5A合成酶，产生一系列短的2′-5′寡腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活2-5A依赖性RNase L，RNase L进一步非特异的降解mRNA，从而对高等脊椎动物体内被侵染细胞内蛋白翻译产生抑制，并可引发细胞凋亡，以达到限制病毒增殖的目的。Mitra将人类的2-5A系统的两个酶以不同启动子驱动导入烟草中，发现转基因株对TMV、AMV和TEV的侵染均表现出了侵染部坏死现象。同时他还发现坏死现象仅局限于叶片部分，而未延伸至这个植株，另外他还发现转基因植株上未接种病毒的叶片没有被侵染，这表明2-5A系统在烟草中表达可以有效的提高植物对病毒的抗性，并具有广谱抗性和特异性特点。Truve则将2-5A系统导入土豆中也获得了相类似的结果。由于2-5A系统来源于高等脊椎动物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，这从一定程度上规避了转基因风险。但目前为止，以2-5A系统转化水稻获得抗病毒转基因材料的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻条纹叶枯病抗性提高的品种的新方法。

本发明所提供的提高水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性水平的方法，是根据人类2’-5’寡腺苷酸酶系统的2-5A合成酶和RNase L可以响应于病毒dsRNA，并通过降解病毒RNA来限制寄主体内病毒增殖的原理，将两基因全长序列导入水稻中使之表达，进而提高转基因品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平。

本发明所提供的能提高转基因受体品种(系)对水稻条纹叶枯病抗性水平的方法，是通过以下方法验证的：

1)从公共数据库获得2-5A合成酶和RNase L两基因全序列，将其分别构建植物表达载体‘

2)转化水稻品种获得转基因再生植株；

3)通过PCR或Southern blot方法多代筛选获得的转基因双阳性水稻品种(系)；

4)通过RT-PCR或Northern blot方法确定转基因双阳性水稻品种(系)中两基因是否正常转录；

5)通过接种鉴定方法表明转基因双阳性水稻品种(系)对水稻条纹叶枯病的抗性水平较转基因受体品种(系)有显著提高。