[发明专利]海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用

权利要求书

1.一种核苷酸序列的表达载体，其特征在于，它是含有来源于海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶基因序列的表达载体pEtac-His₆-amy；它由下列方法制得：将海洋细菌Pseudoalteromonasarctiac GS230低温α-淀粉酶基因的核苷酸序列扩增，与质粒pMD18-T载体连接，得到克隆载体pMD18-T-amy，再将克隆载体pMD18-T-amy和表达载体pEtac-His₆分别经EcoRI和SalI双酶切后连接得到表达载体pEtac-His₆-amy。

2.一种用于表达海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia  coliEGPS230)CGMCC No.2700，它是将权利要求1所述的表达载体pEtac-His₆-amy转化到大肠杆菌中进行IPTG诱导表达得到。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

4.一种用权利要求2或3所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700产重组低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下，

(1)将基因工程菌株以1％的接种量接入装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，在37℃，180rpm下摇床培养，当培养菌液的OD₆₀₀达到1.0时，再加入浓度为1mmol·L^-1诱导剂IPTG，20℃诱导16h，得发酵液；

(2)将发酵液13000×g离心5min后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000×g离心5min去掉上清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，0℃水浴中经超声波破碎5min，13000×g离心10min取上清液即得重组低温α-淀粉酶的粗酶液；

(3)将粗酶液用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得纯化的重组低温α-淀粉酶。

5.一种如权利要求4所述方法得到的重组低温α-淀粉酶，其特征在于：该酶的分子量为51.5KD；适合作用温度30℃，在0℃下有34.5％的酶活力；Ca²⁺有助于提高该酶的热稳定性，酶液分别在20℃保温2.5h后，其残余酶活为73％；该酶的最适作用pH为7.5，金属离子Mn²⁺、K⁺、Na⁺对酶有激活作用，Hg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺能够抑制酶活性；1％的曲通对酶有激活作用，1mmol/L的N-溴代丁酰亚胺对酶有强烈抑制作用，SDS、EDTA、碘乙酸和三氯乙酸对酶有一定的抑制作用；该酶的Km为7.28mg/mL，Vmax为13.07mg·mL^-1·min^-1；该酶分解马铃薯淀粉为麦芽糖和麦芽二、三、四糖。

6.一种如权利要求5所述重组低温α-淀粉酶在淀粉水解中的应用。