[发明专利]一种农杆菌介导的不依赖于组织培养的棉花转基因方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的不依赖于组织培养的棉花转基因方法，包括：

1)在棉花授粉当天下午17:00-19:00或授粉次日上午9:00-11:00，以附加体积比0.05％表面活性剂Silwet L-77和40mg l^-1乙酰丁香酮、含有目的基因的基因工程农杆菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱；

2)套袋遮光保湿两天；

3)种子成熟收获后进行转基因功能鉴定和分子检测；

4)PCR和Southern杂交验证目的基因已整合至目标棉花基因组中，从而获得转基因棉花植株。

2.权利要求1所述方法用于抗除草剂基因转化棉花的方法，其特征在于：

1)选择泗棉3号，在7、8月份棉花开花期，选择次日将要开花的花蕾做自交以备转化之用；

2)农杆菌株为EHA105，质粒为pKF111，该质粒T-DNA区含有Basta除草剂抗性的bar基因，含目的基因bar基因的工程农杆菌保存于附加50mg l^-1卡那霉素和20mg l^-1利福平的固体LB培养基上，挑取工程农杆菌2-3个克隆于含50mg l^-1卡那霉素的液体LB中，28℃培养过夜，4000rpm室温离心5min，弃上清，以质量体积比10％蔗糖重悬并把工程农杆菌细胞浓度调至OD600＝2.0；在农杆菌-蔗糖溶液中加入体积比0.05％表面活性剂Silwet L-77和40mg l^-1乙酰丁香酮备用；

3)开花次日上午9:00-11:00，抹去花柱，用上述附加体积比0.05％表面活性剂Silwet L-77和40mg l^-1乙酰丁香酮的农杆菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱伤口处；或开花当天下午17:00-19:00，农杆菌-蔗糖溶液滴涂柱头；或开花当天下午17:00-19:00，摘除柱头，农杆菌-蔗糖溶液滴涂花柱伤口处；处理后的花和幼龄套袋遮光保湿；

4)收获种子经过消毒后在含有体积比0.05％Basta除草剂培养基发芽，表现除草剂抗性的幼苗进行移栽并正常管理；3个月后，以体积比0.15％和0.3％Basta除草剂处理，选择正常显绿色无除草剂伤害症状的抗除草剂棉花植株；

5)抗除草剂棉花植株提取DNA，进行bar基因的PCR、Southern blot检测，所获得的除草剂抗性植株转bar基因泗棉3号，属陆地棉(Gossypium hirsutum)，于2009年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3275。