[发明专利]一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

权利要求书

1.一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：

①根据NCBI上已报道的水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列及南方水稻黑体矮缩病毒S9核苷酸序列设 计简并引物，引物序列如下：

RB1_S9_F：5`-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3`

RB2_S9_F：5`-TTACAYCAAGCACTTTGCGAGG-3`

RB_S9_R：5`-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3`

②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合           RT引物   检测病毒名称         目的片段大小

RB1_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R  水稻黑条矮缩病毒      1119bp

RB2_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R  南方水稻黑条矮缩病毒  569bp

(2)总RNA提取：

取植物样品组织0.1g，加入1mL Trizol reagent充分研磨，研磨液移入一1.5ml离心管，室温放置 5min；加入氯仿200μL，混匀后静置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离 心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；12,000g，4℃，离心10min，弃去上清；加入1mL 70 ％乙醇洗涤沉淀；干燥RNA沉淀，而后加40μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。

(3)RT-PCR扩增：

①反转录(RT)：

取一Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 3μL，引物RB_S9_R1μL，DEPC处理水8.5μL， 置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：

42℃水浴1h，70℃处理5min，-20℃保存备用。

②聚合酶链式反应(PCR)：

以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：

反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、50-55℃退火50sec、72℃延伸2min，30-40次循环； 最后72℃延伸10min，4℃保存。

(4)电泳检测：

取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL 的溴化乙锭中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察 到一条1119bp的核酸条带，在仅感染南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条569bp的核酸条带， 在同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到569bp和1119bp两条核酸条 带。

2.根据权利要求1所述的快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于PCR 扩增中的退火温度为52-53℃。

3.根据权利要求1所述的快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于PCR 扩增的循环次数为30-35次。