[发明专利]香豆素标记雷公藤内酯醇及其制备方法和应用

说明书

一.技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种香豆素标记雷公藤内酯醇及其制备方法和 应用。

二.背景技术

卫矛科雷公藤属雷公藤的根部提取物作为传统中药，用于治疗免疫性疾病，比如风湿性 关节炎、肾炎、全身性红斑狼疮等已经有了几千年的历史。其中一种二萜类的化合物雷公藤 内酯醇，英文triptolide。是该提取物的主要活性成分。雷公藤内酯醇的化学分子式为C₂₀H₂₄O₆， 分子量为360。目前，它的全合成已经获得成功。作为一种免疫抑制药物，雷公藤内酯醇具 有很好的抗炎、抗肿瘤及抗生育作用，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗，最近又显示其 在器官移植抗排斥反应方面具有广阔的应用前景。

雷公藤内酯醇作为一种药物，目前采用同位素标记的方法来研究其分子的细胞定位，但 是同位素标记方法需要特殊实验条件，同时具有同位素污染产生，对实验人员也有伤害。由 于目前实验手段的局限性，雷公藤内酯醇的细胞定位和分子靶点尚未明确。4-溴甲基-7-甲氧 基香豆素与酸容易形成相应的酯，此类酯有很强的荧光而且相当稳定。这些衍生物的荧光光 谱表明，激发光谱和荧光光谱的峰值分别位于320-340nm和390-420nm处。香豆素标记的雷 公藤内酯醇产生的荧光，不仅为其体内示踪提供更加直观的证据，也可为其药代动力学研究 提供新的参考。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种用香豆素标记雷公藤内酯醇的制备及其应用的方法。

本发明所述香豆素标记的雷公藤内酯醇是一种具有如下特征的分子：

1)分子量：648；2)最大激发波长：320nm；3)最大发射波长：398nm；4)在全波长光 的照射下可发出黄色光；5)生物特性：对于鼠源巨噬细胞株ana-1的IC50为104ng/ml。 具有免疫抑制活性。

本发明所述香豆素标记的雷公藤内酯醇的制备方法是：

1)雷公藤内酯醇的活化：将其14位的羟基进行衍生化活化，在pH9-10条件下，与丁二 酸酐进行酰化反应，反应式如图3所示，得到triptolide 14-succinate，以下称mtp。

2)4-溴甲基-7-甲氧基香豆素标记：mtp与4-溴甲基-7-甲氧基香豆素，以下称Br-Mmc， 按照1∶3的摩尔比在50mg/ml浓度的碳酸钾、丙酮溶剂中反应，37℃，反应1小时。 反应方程式见图4。用大量热水洗涤产物，冷冻干燥即可。

香豆素标记的雷公藤内酯醇的鉴定方法：

1)电喷雾质谱鉴定标记产物：产物分子量为648，见图1。

2)香豆素标记的雷公藤内酯醇，具有明显荧光：最大激发波长320nm，最大发射波长 398nm。且对照组雷公藤内酯醇与标记物Br-Mmc在此波长处无明显荧光。

3)香豆素标记的雷公藤内酯醇具有细胞毒性，可抑制免疫细胞生长。其IC50为160nM； mtp同条件下的IC50为28nM；雷公藤内酯醇同条件下的IC50为13.9nM。

本发明与现有技术方法相比其有益效果是：本发明用香豆素标记雷公藤内酯醇，作为指 示剂，产生的荧光效率高，不易淬灭，相当稳定，使得雷公藤内酯醇体内示踪变得直观可行。 标记后雷公藤毒性的降低也为其体内示踪提供了有利的条件。本发明的主要用途为1)雷公 藤内酯醇及其衍生物mtp的细胞定位；2)雷公藤内酯醇及其衍生物mtp分子靶点的确定3) 雷公藤内酯醇及其衍生物mtp的药代动力学研究。

四.附图说明

图1.香豆素标记的雷公藤内酯醇ESI谱图

图2.雷公藤内酯醇细胞内荧光示踪图

图3.雷公藤内酯醇的活化反应式

图4.雷公藤内酯醇的香豆素标记反应式

五.具体实施方式

以下给出用香豆素标记雷公藤内酯醇制备及示踪的方法的实例。

试剂：雷公藤内酯醇采购自深圳牌牌科技有限公司。4-溴甲基-7-甲氧基香豆素采购自 sigma公司。

香豆素标记雷公藤内酯醇制备：

1)取10mg雷公藤内酯醇，丁二酸酐15mg，4-二甲氨基吡啶0.33mg，溶解在1ml的二氯 甲烷中。

2)用三乙胺调pH值在9-10左右。

3)在磁力搅拌器的搅拌下，室温反应24小时。