[发明专利]罗丹明B人工抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1、一种罗丹明B的人工抗原，其特征在于结构为：

其中，载体蛋白直接与罗丹明B分子中的羧基通过脱水缩合形成酰胺键而共价偶联。

2、根据权利要求1所述罗丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步骤为：

(1)将罗丹明B96mg、DCC 41.2mg、NHS 46mg按1∶1∶2的摩尔比混合，溶解于400ul经无水处理的DMF中，室温密封搅拌过夜；

(2)将混合液1000rpm，离心5分钟，后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃搅拌反应过夜；

(3)将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4℃透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；

(4)透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。

3、根据权利要求2所述罗丹明B人工抗原合成方法，其特征是偶联剂为N，N-二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)。

4、根据权利要求2所述一种罗丹明B人工抗原合成方法，其特征在于载体蛋白可以为牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白或人血清白蛋白或兔血清白蛋白。

5、根据权利要求1所述罗丹明B人工抗原，其特征在于作为免疫原来分别免疫雄性新西兰大白兔和雌性Balb/c小鼠，可分别制备出多克隆抗体和单克隆抗体。

6、根据权利要求1所述一种罗丹明B人工抗原，其特征在于可作为包被原用于ELISA的免疫分析，步骤为：

(1)照板：将聚苯乙烯微孔板置于紫外灯下照射6小时左右；

(2)抗原包被：抗原浓度按1∶200，1∶400，1∶600，1∶800，1∶1000的梯度稀释，不同浓度可根据具体情况而定，100ul/孔，4℃过夜；

(3)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；

(4)封闭：1％明胶封闭，200ul/孔，37℃放置2小时；

(5)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；

(6)样品检测：加入血清，稀释度一般为1∶1000，1∶10000，1∶20000，1∶50000，1∶100000，不同浓度可根据具体情况而定，100μl/孔，同时做阳性对照，37℃放置2小时；

(7)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；

(8)二抗：二抗用PBST稀释，稀释度为1∶10000，100μl/孔，37℃放置1小时；

(9)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；

(10)显色：加入可溶性TMD底物，100μl/孔，37℃放置25分钟；

(11)终止：加入2mol/L硫酸终止反应，50μl/well；

(12)读数：在测定波长为450nm，参比波长为650nm条件下测定吸光值。