[发明专利]一种通过生物技术合成脱氧腺苷三磷酸的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及脱氧腺苷三磷酸技术领域，具体地说，是一种通过生物技术合成脱氧腺苷三磷酸的方法。

【背景技术】

DNA分子是由四种脱氧核糖核苷酸分子结合成的两条互补多聚核苷酸链。合成这些多聚核苷酸的前体是四种脱氧核苷三磷酸，脱氧腺苷三磷酸作为四种原料之一参与核酸分子的体内或体外扩增。随着生物技术工业的发展特别是DNA生物合成和聚合酶链式反应的推广，市场上对DNA扩增所需要的脱氧核苷三磷酸的需求量将会明显地持续升高。另外，由于脱氧腺苷三磷酸在抗病毒抗肿瘤，治疗心血管疾病等方面应用的推广，同样也会对包括本发明所阐述的产品-脱氧腺苷三磷酸的需求量的提高起到促进作用。

目前，商业化的脱氧腺苷三磷酸(dATP)产品主要是由化学合成法实现的(Chambers et al.，1957；Smith and Khorana，1958)；其中，dATP的合成方法包括使用脱氧腺苷单磷酸(dAMP)的三正丁基铵盐与正磷酸在二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下，在吡啶或二甲基甲酰胺(DMF)水溶液中进行反应。dAMP的转化率为70％，dATP的收率在60％左右；而且在转化过程中不可避免地会生成脱氧腺苷二磷酸(dADP)和脱氧腺苷多磷酸等主要副产物。因此在后续的分离中，需要色谱分离方法实现dATP与dAMP和dADP的分离。提纯过程还需要除去未反应的DCC和正磷酸、二磷酸和多磷酸以及还原后的DCC、吡啶或DMF溶剂。在化学转化法所用溶剂属于美国环境保护署列出的有毒化学品。

中国专利申请号00100844中公开了一种通过酶催化和化学反应联合生产脱氧核苷三磷酸的方法；该方法以天然DNA为起始原料，DNA经酶解后，脱氧核苷单磷酸经“脱氧核苷单磷酸酶的催化”反应和相应的化学反应后转化为包括脱氧腺苷三磷酸产品在内的四种脱氧核苷三磷酸；在该方法中，发明者没有对这种“脱氧核苷单磷酸酶”进行具体描述；这种酶的名字也没有被NC-IUBMB(国际生物化学和分子生物学联合命名委员会http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收录和接受，其中的化学法就是上文中所提到的方法。

中国专利申请号02134612公开了一种三磷酸脱氧核苷的生产方法；该方法是将核苷酸还原酶EC1.17.4.2和要转化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反应系统中，使酶的浓度达0.01～0.16单位/ml，使底物浓度达到1～60mmol/L，并加入以维生素B12为基础的辅酶形式的辅酶，以及含巯基还原剂或NADH或蛋白质还原剂，以缓冲液控制溶液pH6～9，于25℃～40℃反应；在该过程中必须使用维生素B-12作为辅酶，以NADH或蛋白作为还原剂。工艺路线与本专利不同。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过生物技术合成脱氧腺苷三磷酸的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种通过生物技术合成脱氧腺苷三磷酸的方法，其特征在于，具体步骤为：

(a)脱氧腺苷酸激酶的克隆，表达和纯化；

脱氧腺苷酸激酶的克隆是指：包含了酿酒酵母的培养，基因组DNA的提取，利用PCR技术从中获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧腺苷单磷酸激酶的基因ADK1，然后利用粘性末端连接法，进行重组质粒pET-17b/ADK1的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；

脱氧腺苷酸激酶的表达和纯化是指：利用2～3mg/ml的细菌溶菌酶加表面活性剂(如0.5％Tween20和0.5％的P450)或超声波破碎细胞，然后使用蛋白分子量截留为3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；

(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；

丙酮酸激酶的克隆是指：自枯草杆菌中获得丙酮酸激酶的基因BYK，重组质粒pET-28a/byk的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；

丙酮酸激酶的表达和纯化是指：利用溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；

(c)用激动剂脱氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游离的脱氧腺苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧腺苷单磷酸合成脱氧腺苷三磷酸；