[发明专利]一种利用种间耦合ATP再生技术制备茶氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种茶氨酸的制备方法，具体是一种利用种间耦合ATP制备茶氨酸的方法，属于酶工程技术领域和微生物发酵技术领域。

背景技术

ATP再生技术(ATP regeneration technology)是一类把ATP生成过程和需消耗ATP的酶反应紧密联系，以促进需消耗ATP的酶反应顺利进行的技术。目前ATP再生技术处于探索阶段和接近实际应用阶段，正面临突破，它是中间产物发酵法和酶工程的瓶颈技术，是实现用微生物细胞(或酶)生产众多生物活性物质产品的关键技术，对其深入研究以期在特殊环境下对ATP再生这一生物化学过程实现调控。按照ATP再生和酶转化底物是否由同一菌种完成，ATP再生技术分为自耦合ATP再生技术(ATP再生和酶转化底物由同一菌种完成)和种间耦合ATP再生技术(ATP再生和酶转化底物分别由两个不同菌种完成)。由于种间耦合ATP再生技术能够广泛地选择高活性的产物合成酶和高ATP再生能力的面包酵母或嗜热脂肪芽孢杆菌相结合，其应用更接近实用阶段。

茶氨酸是茶树组织合成的特有氨基酸。茶氨酸具有改善食品风味、改善睡眠、益智、静心安神、改善经期综合症、产生欣快感、抗疲劳、防止老年性痴呆、抗高血压、抗肿瘤、神经细胞保护等等应用方面。茶氨酸是一种具有多种生理效应的特殊氨基酸，在食品添加剂方面已有广泛应用，在功能食品方面崭露头角，在医药方面有待开发，市场潜力巨大。茶氨酸工业化生产的主要4种，分别为提取法、组织培养法、化学合成法、微生物转化法。国内的研究未能形成大规模的工业化生产。微生物转化法是最有发展前景的茶氨酸工业化生产方法，也是目前茶氨酸商业生产国日本的主要生产方法。

现有技术中关于ATP再生技术及制备茶氨酸的状况如下：

1、日本有采用共培养技术生产茶氨酸的文献报道，其实质采用的是面包酵母作为ATP再生菌，假单胞菌为产酶菌种，催化茶氨酸转化生产中γ-谷氨酰基转移反应的酶是假单胞菌所产的谷氨酰胺合成酶，但文献报告并没有明确提出种间耦合ATP再生技术的概念。

2、国内外有关种间耦合ATP再生技术生产品的报道，但没有采用此技术生产茶氨酸的报道。

3、国外有嗜热脂肪芽孢杆菌是最佳ATP再生菌种的报道，但没有该菌用于制备茶氨酸的报道。

4、国内外有γ-谷氨酰基转移酶用于茶氨酸制备的报道，但是选择的是大肠杆菌生产的γ-谷氨酰基转移酶来生产茶氨酸，没有选择地衣芽孢杆菌所产生的γ-谷氨酰基转移酶来生产茶氨酸的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补已有技术的不足，提供一种新型的、高效的、生产过程稳定、副产物少的利用种间耦合ATP再生技术制备茶氨酸的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种利用种间耦合ATP再生技术制备茶氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌制备γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞；以嗜热脂肪芽孢杆菌制备1、6-二磷酸果糖转化培养液；

(2)将γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞、1、6-二磷酸果糖转化培养液和底物混合，经转化制得茶氨酸转化液；所述底物是谷氨酰胺或谷氨酸和乙胺的混合物；

(3)茶氨酸转化液经提取、精制得到茶氨酸。

上述步骤(1)中所述制备γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞是以地衣芽孢杆菌作为产酶菌种进行产酶发酵制得γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞。

上述步骤(1)中所述制备1、6-二磷酸果糖转化培养液是以嗜热脂肪芽孢杆菌作为ATP再生菌种经活化培养后经过转化培养制得1、6-二磷酸果糖转化培养液；所述以嗜热脂肪芽孢杆菌作为ATP再生菌种经活化培养转化制得1、6-二磷酸果糖转化培养液是以嗜热脂肪芽孢杆菌利用含有蔗糖、无机磷酸盐的营养基质生产供能体1、6-二磷酸果糖，制备成1、6-二磷酸果糖转化培养液。

本发明种间耦合ATP再生技术的过程概括为：(1)分别建立供能系统和酶反应系统；(2)将两个系统耦合，实现ATP再生和促进酶反应。详述如下：

本发明建立酶合成反应系统是采用筛选获得的高活性的γ-谷氨酰基转移酶产酶菌种(地衣芽孢杆菌)经产酶发酵后，制备成γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞，该固定化细胞和酶合成反应底物谷氨酰胺(或谷氨酸)和乙胺一起构成酶合成反应系统。

本发明建立ATP供能系统是采用嗜热脂肪芽孢杆菌利用蔗糖、无机磷酸盐等为营养基质生产供能体1、6-二磷酸果糖(FDP)，制备成FDP转化培养液。其中高活性的乙酸激酶和高含量的能量供体FDP可满足茶氨酸生产过程中ATP再生的需要。