[发明专利]二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及二乙氧基硫代磷酸酯类有 机磷农药广谱特异性多克隆抗体及其制备方法和在有机磷农药多残 留ELISA检测方法中的应用。

背景技术

农药残留问题严重危害着人民群众的身体健康。有机磷类农药由 于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但是有机磷农药，作为 神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常等症状。 在2002年中华人民共和国公布的第199号公告上明令禁止在蔬菜、 果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用的有机磷农药有17种， 而含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的农药就有8种。加强农残检测、 提高分析检测水平是控制农药残留的重要手段之一。

目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特 异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药 种类较多，单组分试剂盒很难实现高通量快速的检测，虽然仪器多残 留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂 贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难 适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已 经是国内外残留分析的一种新趋势。

目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国内外仅有少量 用多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的研究 报道，Suedi，Johnson，Banks，Alcocer等相继研究了有机磷农药的共 有结构，设计出能够识别相似结构的“簇抗原”，利用交叉反应，制 备出“簇多克隆抗体”，并研究了该抗体对几种有机磷农药的选择性 和亲和力，其中有的“簇多克隆抗体”已经应用于有机磷农药多残留 的检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够。2002年，Mi Soon Jang 报道了用其设计的两种半抗原免疫动物后制备的单克隆抗体实现了 一类有机磷农药的多残留检测。2005年，刘贤金等公开了“用于检测 有机磷农药残留的免疫抗体及其应用”，以二乙基膦酸乙酸为半抗原， 不需要进行结构改造即可与蛋白质偶联用于免疫动物，从而制备的抗 体可以检测多种有机磷农药，但可以检测的农药没有针对性，检测限 差异很大。可见作为广谱特异性抗体制备这个关键课题还没有很好解 决。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供二乙氧基硫代磷酸 酯类有机磷农药抗体，是一种多克隆抗体，具有广谱特异性，实际应 用性强。

本发明的另一个目的是提供所述抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述抗体在有机磷农药多残留ELISA 检测方法中的应用。

本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。

本发明的技术方案是：

提供二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，通过在二乙氧基硫 代磷酸酯结构上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原，半抗原偶联 牛血清蛋白(BSA)制备免疫原，免疫原免疫新西兰大白兔制备得到。

所述抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原配合弗氏佐剂免 疫实验动物；

(2)免疫4次后动脉取血，分离抗血清；

(3)抗血清经过抗体纯化步骤得到目标抗体。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原的制备方法包括以 下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原与DCC，NHS 反应形成活泼酯；

(2)将活泼酯滴加入一定浓度的蛋白溶液中，反应过夜；

(3)偶联有二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原的蛋白用 生理盐水透析3天得到目标抗原。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原，所述半抗原优选 乙氧基硫代磷酰氯与羟基肉桂酸或氨基酸在0℃下于甲醇中进行亲核 取代反应的产物，其制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酰氯与羟基肉桂酸或氨基酸在0℃下于甲 醇中进行亲核取代反应；

(2)反应结束，旋转蒸干，复溶于碱性溶液，酸化即可生成目 标半抗原。