[发明专利]一种细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力的测定方法

权利要求书

1.一种细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)将待测细菌培养至稳定生长期，收集菌体，去除培养基；

(b)配置反应液：在M9缓冲液的基础上添加待测细菌所需的单一电子供体和单一电子 受体，所述的M9缓冲液是含有5.7mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，3.3mmol/L KH₂PO₄， 18.0mmol/L NH₄Cl的水溶液；

(c)确定加入反应液中DCCD的用量：

分别在若干相同体积的(b)步骤配置的反应液中加入不同剂量的二环己基碳 二亚胺DCCD，形成若干含有不同浓度DCCD的反应液，使各反应液的DCCD的 浓度呈一浓度梯度；在各反应液中分别加入(a)步骤收集的菌体，使各反应液中 的菌体浓度相同，在无氧条件下测定各反应液的pH值变化，以pH值出现下降过 程最后趋于稳定的反应液的DCCD剂量为测试用量；

(d)测定厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力：

在(b)步骤配置的反应液中加入(c)步骤测定的DCCD一种测试用量，所述 的反应液的体积与(c)步骤中一种未加入DCCD的反应液的体积相同，由此形成 测定反应液，在该测定反应液中加入(a)步骤的收集的菌体，使得菌体浓度与所 加入的该种DCCD测试用量的(c)步骤反应液中的菌体浓度相同，在无氧条件下 测定反应液的pH值变化，pH值出现降低过程直至稳定不变，测定的pH变化值即 为细菌膜内外质子动力。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于(d)步骤中在反应液中加入的DCCD测试 用量是(c)步骤中确定的各DCCD测试用量中的最小剂量。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于在所述的反应液中添加单一碳源，矿质元 素和维生素。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤(a)中所述的去除培养基是应用0.8％ 生理盐水洗涤。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于在(c)步骤和(d)步骤中加入到反应液 中的所述的菌体量为占反应液体积10％的菌液收集的菌体。

6.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的矿质元素的组份及含量为1.01mmol/L MgSO₄、0.5g/LMnSO₄、0.1g/LZnSO₄、0.01g/LCuSO₄、0.01g/LAlK(SO₄)₂、1.0g/LNaCl、 0.1g/L FeCl₂、0.1g/L CaCl₂和CoCl₂0.1g/L。

7.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的维生素的组份及含量为2mg/L生物 素、2mg/L叶酸、10mg/L维生素B6、5mg/L维生素B2、5mg/L维生素B1、5mg/L烟 酸、5mg/L泛酸、0.1mg/L维生素B12、5mg/L对氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸。

8.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的待测细菌为脱色希瓦氏菌S12，所述 的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度为10mmol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓度为 10mmol/L，单一电子受体柠檬酸铁，终浓度为1mmol/L或者单一电子受体为苋菜红，其 终浓度为0.1mmol/L。

9.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的待测细菌为大肠杆菌DH5α，所述 的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度为10mmol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓度为 10mmol/L，单一电子受体柠檬酸铁，终浓度为1mmol/L。