[发明专利]一种低产蛋白酶A的啤酒酵母的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，属于生物与发酵工程领域。

背景技术

纯生啤酒的泡沫稳定性衰减问题已成为其质量保证的难题，同时又是世界范围内的研究重点。由于纯生啤酒是不经过热处理而采用物理方式除菌，所以纯生啤酒中含有啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A，其可能消化有助于啤酒泡沫稳定性的蛋白质，同时产生没有起泡性能的多肽，导致最终成品啤酒中泡沫稳定性变弱。蛋白酶A对啤酒泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴趣，尤其在国内纯生啤酒高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A的活性问题更引起人们的重视。

通过以下三种途径可以降低蛋白酶A对纯生啤酒泡沫的影响：第一种途径是工艺控制，限制酶的产生和分泌。酵母在处于不利的生理条件下时蛋白酶A分泌会增多，例如氮缺乏、高乙醇浓度、高二氧化碳含量、高的渗透压。控制好这些工艺条件，可以有效地降低蛋白酶A在发酵液中的活性，从而减少在成品酒中的活性。第二种途径是用抑制剂对啤酒进行后修饰。通过添加酵母蛋白酶A的抑制剂抑制发酵结束后已分泌的蛋白酶A活力，从而降低蛋白酶A在货架期对啤酒泡沫稳定性的影响，例如，中国发明专利申请CN101298586A所公开的一种降低啤酒发酵过程中蛋白酶分泌量的方法。第三种途径是通过遗传育种的方法选育低产蛋白酶A啤酒酵母菌株，主要包括基因工程技术及诱变育种、杂交育种等方法，例如，中国发明专利申请CN1948462A所公开的一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用。通过工艺控制，增加工艺来实现对酵母分泌蛋白酶A活性的控制，增耗人力物力。通过添加抑制剂降低蛋白酶A活性，目前的研究还比较少，并不是很成熟。在啤酒酿造时，只有选用产蛋白酶A活性低的酵母菌株，才能从根本上解决纯生啤酒泡沫衰减问题。因此选育低产蛋白酶A菌种对于改善纯生啤酒泡沫性能至关重要。

无论是应用常规的物理和化学诱变方法还是通过基因工程的方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离出低产蛋白酶A菌株的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法。蛋白酶A是酵母中目前所知的唯一一种在酸性pH范围内水解酸变性血色素(acid-denatured hemoglobin)的酶，本发明利用蛋白酶A的这一特性从大量的诱变菌中筛选出产蛋白酶A低的酵母菌落，从而将上游的菌株改造技术与最终的菌株分离获得结合起来，在菌体经过改造处理后，快速地分离获得目的菌株，减少选育过程的盲目性，增强预见性，提高育种效率。

本发明所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将被筛选啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培养2-3天；

(2)挑选生长旺盛的菌落接种至甘油平板，28℃培养3天，激活蛋白酶A活性；

(3)将酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，37℃放置2-3天；

(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平铺，根据水解圈大小判断蛋白酶A的酶活高低，将水解圈小的菌株筛选出来，获得要筛选的目标菌株。

其中，所述YPD平板的成分为：2％(w/v)葡萄糖；2％(w/v)蛋白胨；1％(w/v)酵母浸粉；2％(w/v)琼脂。所述甘油平板的成分为：2％(w/v)甘油；1％(w/v)蛋白胨；1％(w/v)酵母浸粉；2％(w/v)琼脂。所述酸变性血红蛋白覆盖液的成分为：1.5％(w/v)琼脂；0.3％(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白；0.22％(v/v)Triton X-100；0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液。所述三氯醋酸的浓度为10％(v/v)，添加量优选为1-2ml。

所述酸变性血红蛋白覆盖液通过以下步骤制得：

A.配制0.1M，pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液；

B.配制3％(w/v)的血红蛋白溶液，用4M的HCl溶液调节pH值至1.0，放置1.5小时并同时在紫外灯下照射30-40分钟后，用0.1M的NaOH溶液调节pH值至3.0，然后用步骤A所制得的甘氨酸-盐酸缓冲液进行稀释，制得1％(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白溶液；

C.配制0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液，121℃下灭菌15min；

D.将琼脂粉、Triton-X100溶解于0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液中，煮沸至琼脂溶解，然后冷却(但不要凝固)；

E.将步骤B所制得的酸变性血红蛋白溶液与步骤D所制得的混合溶液按照体积比为3∶7的比例混合均匀。