[发明专利]一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于食品微生物安全监测领域，具体地是涉及一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是奶粉中近几年引起广泛关注的一种致病菌。阪崎肠杆菌原称黄色阴沟肠杆菌，直到1980年才被认为是一个新的菌种，并以日本微生物学家——Riichi Sakazakii的名字命名，即阪崎肠杆菌。2008年，食品卫生法典委员会同意考虑创建一个新属Cronobacter，Cronobacter包括阪崎肠杆菌和相关种。阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性致病菌，其周生鞭毛、能运动、无芽孢和兼性厌氧。

阪崎肠杆菌在自然界的污染源仍然不清楚(Friedemann等，2007；Lin等，2007)，在多起暴发事件中发现，阪崎肠杆菌的感染与婴幼儿配方奶粉密切相关(Iversen等，2004)。从大多数病例看，婴幼儿(主要是1岁以下)特别是出生28天以内、早产儿、低体重儿或免疫缺陷的婴幼儿更容易被阪崎肠杆菌感染，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率高达80％。不仅如此，阪崎肠杆菌也能引起成人的骨髓炎、菌血症和恶性肿瘤。2002年国际食品微生物标准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌。FAO/WHO把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌。

自从阪崎肠杆菌造成的危害得到频频报道后，食品中特别是婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测就显得非常重要。目前大部分实验室都参考美国食品及药品管理局(FDA)于2002年制定的阪崎肠杆菌分离和计数方法，这是国际上颁布的第一个官方方法。2006年，ISO和国际乳品联盟(IDF)联合公布了“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”方法即ISO/TS 229641 IDF/RM210。近年来国内外还发展了针对阪崎肠杆菌的分子生物学检测方法(李兆辉等，2006；Hassan et al，2007)。由于阪崎肠杆菌在奶粉中的污染水平很低(0.36-66CFU/100g)，而且奶粉不是无菌产品，可能会存在各种杂菌的污染，从而在检测阪崎肠杆菌时候会有其他菌的干扰或者竞争，影响检出率。因此，迫切需要建立新的样品前处理方法，用于富集奶粉中的阪崎肠杆菌，提高检出率。

免疫磁珠是由直径3～5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠经不同单克隆抗体包被而成的颗粒，而免疫磁珠分离方法(immuno-magnetic separation，IMS)是于70年代中期发展起来的一项免疫学技术。IMS用于食源性致病菌检测领域的原理是：用特异性抗体包被在磁珠表面来捕获检样(或增菌液)中的目标致病菌，然后在磁场的作用下被吸附沉淀，使目标致病菌与影响和干扰检测灵敏度的检样残渣和其他杂菌分离开，起到浓缩作用，从而提高检测的灵敏度和检出率。如在李斯特氏菌检测中，采用免疫磁珠技术的检出率显著高于标准培养法，后者检出率仅为前者的36％。

IMS方法操作简便，只在检测样品或者增菌液中加入免疫磁珠，室温振荡混匀一定的时间后，在磁场作用下反复用缓冲液洗涤即可，捕获目标菌的免疫磁珠不用与目标菌分离，直接进行后续实验。由于IMS方法具有许多优点：1、分离速度快，效率高、可重复性好；2、操作简单，不需要昂贵的仪器设备；3、不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等，因此在微生物检测方面具有很大的优势。目前，用IMS检测食品中常见的沙门氏菌(Salehi et al，2007)、单增李斯特菌(Uyttendaele et al，2000；Yang et al，2007)和大肠杆菌0157(Jenkins et al，2003；Lee J H et al，2006)等已渐渐成熟，并且已得到越来越多的应用。而且IMS也已成功用于从实际样品中检测志贺氏菌(Islam et al，1992)、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪链球菌、白色念珠菌、空肠弯曲菌以及白色葡萄球菌，但尚未有阪崎肠杆菌的免疫磁珠富集方法报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种富集阪崎肠杆菌的试剂，该试剂可以直接从样品中或前增菌培养液中富集目标微生物，起到浓缩作用，解决了样品前处理的瓶颈问题，提高了检测灵敏度和检出率。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种富集阪崎肠杆菌的试剂，包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。优选地，