[发明专利]Nanog抑制型突变体及其在Nanog功能研究中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及Nanog抑制型突变体的构建、表达以及其在Nanog的功能研究中的用途，所述Nanog是一个Homeobox家族基因，可以不依赖于LIF而维持胚胎干细胞的多能性，是在干细胞的多能性、自我更新及重编程过程中起重要作用的转录因子。

背景技术：

胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)来自于哺乳动物的胚泡(Blastocyst)的内细胞团(InnerCell Mass，ICM)，是最为原始的干细胞，具有发育的多能性。ES细胞区别于其他的细胞最基本的生物学特性，主要有三个：第一，ES具有多能性(pluripotency)，所谓多能性即ES细胞具有多向的分化潜力，首先它可以分化为内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的细胞，进而分化成各种各样的细胞类型；第二，具有自我更新的能力或者无限增殖能力(self-renewal)；第三，具有整合的能力，即将ES细胞注射到早期发育的胚胎中，ES细胞可以整合到胚胎中并可随胚胎一起发育，能分化成为任何的组织并形成嵌合体(MintzB，等人，(1975)Proc Natl Acad Sci U S A，72：3585-3589；Illmensee K，等人，(1976)Proc Natl Acad Sci U S A，73：549-553；Evans MJ，等人，(1981)，Nature，292：154-156)。研究ES细胞维持自我更新能力和分化潜能的分子机制非常重要，也是胚胎干细胞能应用于临床的基础。因此，基于干细胞这种全能性或多能性特性的疗法是现在许多待解决疾病(例如帕金森氏病)的一种很有前景的解决方案。但是，在将人的ES细胞安全和有效地应用到治疗人类疾病之前，我们必须克服人ES带来的很多难以克服的障碍。目前，ES细胞的基础生物学研究还不是很清楚，需要进一步深入地了解干细胞具有这种全能性或者多能性的分子机制。

干细胞的多能性以及自我更新能力的维持，需要多条信号通路以及各种转录因子来协调。其中，维持小鼠ES细胞的多能性的转录因子包括Oct4、Sox2、FoxD3和Nanog(Pan，G.，等人，(2006)Faseb J20(10)，1730-1732；Boyer，L.A.，等人，(2005)Cell 122(6)，947-956；Mitsui，K.，等人，(2003)Cell 113(5)，631-642；Chambers，I.，等人(2003)Cell 113(5)，643-655)，但是关于干细胞维持多能性及自我更新的分子机制还不是很清楚。

在这些转录因子中，小鼠Nanog，是第一个被发现在高表达的情况下可以在不需要LIF通路的情况下维持小鼠干细胞的多能性(Mitsui，K.，等人，(2003)Cell 113(5)，631-642；Chambers，I.，等人(2003)Cell113(5)，643-655)。小鼠Nanog蛋白是由305个氨基酸组成，并且包含有一个Homeobox保守结构域。Nanog的表达模式和Oct3/4很相似，也只是在多能性干细胞中表达，而在分化的成熟细胞中完全消失(Mitsui，K.，等人，(2003)Cell 113(5))。在小鼠胚胎发育的过程中，Nanog的表达会随着这些多能性细胞的分化而逐渐下降(Chambers，I.，等人(2003)Cell 113(5)，643-655)。Nanog被认为在维持ICM和ES多能性发面发挥着决定性的作用。Oct3/4是通过阻止ICM和ES细胞向滋养外胚层方向分化来维持其多能性。与Oct3/4的作用模式略有不同，Nanog不仅可以独立阻止ES细胞向内胚层方向分化，而且还可以主动的维持多能性(Mitsui，K.，等人，(2003)Cell 113(5))。Nanog敲除的小鼠胚胎由于缺少epiblasts而不能发育到囊胚阶段(Mitsui，K.，等人，(2003)Cell 113(5))。Nanog敲除的ES对于小鼠的ES细胞而言，Nanog最重要的角色就是高表达的Nanog可以不依赖于外源性信号因子Lif而维持多能性，表明Nanog可能是外源性信号因子的主要的下游作用基因。作为一个维持ES细胞多能性的重要转录因子，小鼠Nanog只有进入细胞核才能发挥作用，但是至于Nanog的进核机制至今还没有人报道。在此我们证明了核定位信号突变的Nanog发挥着抑制型突变体的功能，影响野生型Nanog的核定位和转录激活能力，这可以为一个非常有用的抑制型工具来研究小鼠Nanog的功能。

发明内容：