[发明专利]一种抗肿瘤DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种医用配制品，特别是用于基因治疗的医用配制品。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的疾病，据不完全统计，我国每年死于肿瘤的患者约130万人，全世界每年约700万人被肿瘤夺去了生命。手术、放疗、化疗仅能治愈45％左右的肿瘤，55％的肿瘤病人因晚期或高度恶性而无法治愈。肿瘤的预防和治疗已成为全球的医药工作者的重要使命，各国都投入了大量的人力和物力。

肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的一种重要手段，已成为抗肿瘤研究的热点之一。肿瘤疫苗是通过接种引起细胞免疫和体液免疫反应，激发人体自身的天然抗肿瘤反应，达到防治肿瘤的目的。

目前，研究较多的肿瘤疫苗有全细胞疫苗、核酸疫苗、抗原疫苗和以树突状细胞为基础的疫苗等，其中核酸疫苗(亦称为DNA疫苗或基因疫苗)是近10年发展起来的一种新型疫苗。DNA疫苗通常是单质粒DNA表达载体，载体中一般含有目的基因的编码序列、真核启动子、聚腺苷酸化序列、抗生素抗性基因和复制起止点。真核启动子和聚腺苷酸化序列是目的抗原在哺乳动物细胞中表达所需的，抗生素抗性基因和复制起止点能使载体在细菌中复制；当在肌肉或皮下接种裸DNA质粒后，宿主细胞摄取DNA，产生抗原以诱导免疫应答，诱导抗原特异性CD4+辅助性T细胞、CD8+CTL和抗体的产生。在肿瘤的免疫治疗中，DNA疫苗具有以下优点：(1)任何肿瘤相关抗原都很容易处理成质粒DNA的形式进行免疫治疗；(2)与全长蛋白或重组病毒相比，DNA容易大量生产；(3)质粒DNA的接种不会引起非相关蛋白的表达，能反复接种；(4)与病毒载体相比，到目前为止DNA疫苗在临床试验中表现出良好的安全性；(5)靶向未突变的肿瘤相关分化抗原的DNA疫苗能用于较大范围的病人；(6)DNA疫苗的CPG基序可以激活天然免疫系统来控制肿瘤细胞的生长。以往研究的DNA疫苗所含的目的基因大多为单独抗原的编码序列，所引起的特异性免疫应答一般只对有该抗原表位的肿瘤细胞有效，但是肿瘤抗原和肿瘤细胞呈多态性及个体特异性，查明每一个患者的抗原表位是不可能的，即使使用明确的一种或几种肿瘤抗原以及肿瘤相关抗原免疫治疗肿瘤，也不可能杀伤肿瘤组织内所有肿瘤细胞。

自杀基因是来自某些病毒或细菌的基因，可编码特定的酶，正常哺乳动物细胞缺乏这种基因，如果将其导入靶细胞中，可使无毒性的前体药物转化为细胞毒性代谢产物干扰DNA合成，从而导致靶细胞死亡。不少研究表明，只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀死，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”。将自杀基因引入肿瘤疫苗的报道较少，Ren等以复制缺陷腺病毒携带人热休克蛋白70基因和自杀基因HSV-tk共表达质粒制成肿瘤疫苗，该疫苗中所含的人热休克蛋白70基因和自杀基因HSV-tk共表达质粒，实验证明该疫苗对鼠肿瘤产生了明显的抑制作用(Wenhong Ren，Randy Strube，Xiaoqing Zhang，etal.Potent Tumor-SpecificImmunity Induced by an In vivo Heat Shock Protein-Suicide Gene-Based Tumor Vaccine[J]CANCERRESEARCH，2004，(15)64，：6645-6651)，但是该疫苗存在以下两个缺点：(1)采用病毒为载体，在机体内复制率虽高，但靶向性不高，且难以清除，安全隐患较大；(2)质粒中采用的人热休克蛋白70基因，对于应用到人体抗肿瘤时免疫源性较弱，易产生免疫耐受。

发明内容

本发明要解决的技术问题是DNA疫苗免疫原性不强及对肿瘤靶向性不强。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗由人体益生的兼性厌氧细菌、人体益生的厌氧细菌、减毒的兼性厌氧细菌或减毒的专性需氧菌携带pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因构成；所述的pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因是以pCMV质粒为表达载体，以结核杆菌热休克蛋白70(英文名称的缩写为mt Hsp70)基因和自杀基因为抗原基因构成的重组质粒，其中所述的结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因分别位于pCMV质粒中的内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)的上游和下游。图1为本发明pCMV-mt

Hsp70-IRES-自杀基因的结构简图。