[发明专利]BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的是涉及BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。

背景技术

BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调节细胞的生长、增值和凋亡。现在已普遍认同的是BRAF基因第15外显子上的T1799A突变导致BRAF蛋白产物的600残基中的缬氨酸被谷氨酸替代(V600E)，进而持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞无限制分裂、增值。。BRAF基因突变其它位点出现的频率较低，据报道BRAF突变率为15％左右，且90％以上为外显子15的V600E突变。

目前，很多实验室在对BRAF基因研究分析中，会碰到例如检测的灵敏度和特性都很低的困难。已经建立的BRAF基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用最广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性也差，对于要求高时效性和高灵敏度临床检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其灵敏度可以达到1％-2％，检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供BRAF基因外显子15突变检测的探针序列。

用于BRAF基因外显子15突变检测的探针：包括有

选自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2任一种的、针对外显子15的野生型探针，和选自于SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4任一种的、针对外显子15的突变型探针。

本发明的另一目的是提供BRAF基因外显子15突变检测液相芯片。

实现上述目的的技术方案如下：

一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有：(A)包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.1～SEQID NO.2任一种的、针对外显子15野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4任一种的、针对外显子15突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及

(B)用于扩增出具有BRAF基因外显子15突变位点的目标序列的引物，该引物带有酶切位点，且扩增到的目标序列的末端具有生物素标记。

以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-30个T。