[发明专利]CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及苯妥英钠代谢相关基 因CYP2C9、CYP2C19突变检测液相芯片及其检测方法。

背景技术

苯妥英钠为抗癫痫药、抗心律失常药，常用于颅脑手术后癫痫的预防，以及癫痫尤其是 癫痫大发作的治疗。这种药物始用于20世纪初，长期作为治疗癫痫的一线药物，其疗效虽好 但有较多与剂量相关的不良反应，且个体差异很大。患者若使用剂量不足，药物不能达到预 期疗效；而稍有过量，又会对患者的神经系统造成严重的毒副作用。苯妥英钠的毒副作用常 见为齿龈增生，儿童发生率高；对神经系统的不良反应常见为眩晕、头痛，严重时可引起眼 球震颤、共济失调、语言不清和意识模糊；此外，血液系统、骨骼系统以及消化系统亦会受 到用药剂量不当的影响。

大量的临床研究已经证实，苯妥英钠的疗效与患者体内两个基因的突变关系密切，即 CYP2C9和CYP2C19。苯妥英钠70％～90％由CYP2C9代谢；而CYP2C19是其代谢过程中最重要的次 级代谢酶，CYP2C19的作用随药物浓度的升高而增强。CYP2C9和CYP2C19对降低苯妥英钠毒性 和促使其排泄出体外具有关键作用。

在中国人群中，CYP2C9常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2C9*2和CYP2C9*3，其中 CYP2C9*3基因分布频率约2.5％；CYP2C19常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2C19*2和 CYP2C19*3，基因分布频率分别约为29.7％和3.5％。其中，CYP2C9*2为C430T突变，发生在外显 子3；CYP2C9*3为A1075C突变，发生在外显于7；CYP2C19*2为G681A突变，发生在外显子5； CYP2C19*3为G636A突变，发生在外显子4。这些等位基因的突变使酶活性降低，对药物代谢的 能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定的规律性，表现出正常基因纯合子>正常基因与 突变基因杂合子>突变基因纯合子或杂合子的变化趋势，即我们通常所说的基因剂量效应。 大量研究表明，携有一个或以上功能减弱等位基因突变的患者，在接受苯妥英钠治疗时，如 果不适当减少剂量，将面临较大的毒副作用风险。

目前已建立了若干以PCR为基础的检测CYP2C9和CYP2C19基因SNPs的技术，如直接测序法， 半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污 染、假阳性率高等缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的 需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的 等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵， 而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微 球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪 作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造 过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不 同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物 素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完 整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光 用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同 色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通 过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测 试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确， 灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多种 突变，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。

发明内容

本发明的目的之一是提供与苯妥英钠疗效密切相关的CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液 相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2C9基因的两种常见突变等位基因CYP2C9*2和CYP2C9*3， 以及CYP2C19基因的两种常见突变等位基因CYP2C19*2和CYP2C19*3。

一种CYP2C9和/或CYP2C19基因突变检测液相芯片，包括有：