[发明专利]一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法

权利要求书

1.一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤：

步骤1：从腔静脉组织中分离出中膜组织进行消化得到平滑肌细胞，并进行培养， 获取原代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，

步骤2：获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，

其特征是，所述步骤1从腔静脉组织中分离出中膜组织的具体过程为：从腔静脉组 织中分离出中膜及内膜，放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4℃静置20～30min，再 放入HBSS平衡溶液中，室温静置10～20min；然后取出翻转管壁，使内表面朝外，密封 管腔；放入消化液中35～37℃消化3-5min，使内膜被消化脱落，去除内膜，得到中膜 组织；

所述步骤1平滑肌细胞的原代培养过程为：

a>将中膜组织放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中室温静置5-10min，然后用消化 液在35～37℃消化10～15min，吸出消化液，加入混合培养基室温放置，然后使之成细 胞悬浮液，静置至组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集另存；再将原消化液加入原离心管 中，重复上述步骤进行再次消化和收集细胞悬浮液；合并细胞悬浮液；

b>对细胞悬浮液进行离心，弃上清液；经PBS清洗后，加入混合培养基，使细胞 悬浮于培养基中，调整细胞密度并种植于培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养， 3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的 大鼠腔静脉平滑肌细胞；

所述的步骤2的具体操作是：当原代细胞达到90％融合密度后，用PBS溶液清洗， 加入0.1～0.25％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，除去胰蛋白酶溶液，清洗细 胞，加入混合培养液，使细胞悬浮于培养基中，然后接种于另一培养瓶中进行培养，至 细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞；

所述的消化液为：含6.9-7.1mg/ml I型胶原酶、0.3～0.5mg/ml木瓜酶、1.9～ 2.1mg/ml牛血清白蛋白和0.13～0.15mg/ml二硫苏糖醇的HBSS平衡盐溶液；

所述的混合培养液为含95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的链霉素和10～20％ 胎牛血清的低糖DMEM培养液；

所述的HBSS平衡盐溶液为：7.55-7.70g氯化钠、0.37-0.39g氯化钾、0.24-0.26g 氯化镁、1.75-1.85g葡萄糖和2.23-2.25g HEPES，用水定容至1L；

所述的含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为：由所述的HBSS平衡盐溶液与1M氯化钙溶 液按体积比1∶0.00015-1∶0.00016配制而成。

2.根据权利要求1所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述步 骤a>中混合培养基的用量为3～6ml，室温放置2～5min；重复消化中膜组织及收集细胞 操作2～4次。

3.根据权利要求1所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述步 骤b>中细胞密度为1～2×10⁵细胞/ml。

4.根据权利要求1所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述的 步骤2中的胰蛋白酶溶液的用量为0.3～0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02％EDTA；所述 的细胞接种密度为1～2×10⁵个/ml。