[发明专利]诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液

说明书

技术领域

本发明涉及诱导干细胞分化的技术领域，具体涉及一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液。

背景技术

糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的主要杀手。目前在针对糖尿病病因病理的各种治疗措施中，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症；近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。基因/细胞治疗越来越受到人们的关注。胰-十二指肠同源盒1基因(PDX1)是决定胰腺分化发育和胰岛功能的主要调节基因。因此是这一治疗最具希望的候选基因。

利用PDX1对非β细胞进行直接或间接修饰很可能是今后糖尿病基因治疗中极具潜力的一个发展方向。PDX1基因可以在不同载体的介导下直接导入体内，诱导非β细胞中内源性胰岛素的表达。但是以病毒为载体的介导方式在临床应用中存在安全问题，因此迫切需要一种安全的、高效的介导方法。

其中TAT蛋白转导域是一种倍受瞩目的跨膜递送载体的方式。它不但自身可以跨膜进入细胞，而且能把与它融合的其它超过50种的蛋白和其它外源物质带入细胞。TAT是一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1的转录激活因子，能够有效引导肽段或者蛋白质穿透细胞膜，其分子中具有蛋白转导作用的结构是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，这一多肽片段称为蛋白转导结构域。其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRR。它可以非常高效将与其融合的蛋白质转入各种细胞及细胞核中并发挥该蛋白质的功能。通过TAT蛋白转导域技术将PDX1蛋白导入到人胎肝间充质干细胞内，获得有功能的胰岛素产生细胞，将为糖尿病的干细胞治疗提供一种新的种子细胞。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的首先是提供一种用于诱导人胎肝间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human fetalliver，hFL-MSCs)向胰岛β样细胞分化的诱导液。本发明的另一目的是提供一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种诱导液，是在细胞培养液中添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。

所述TAT-PDX1融合蛋白可从市售渠道或通过重组蛋白纯化技术得到。

所述TAT-PDX1融合蛋白的摩尔浓度优选20mol/L。所述细胞培养液优选含3％～5％体积浓度胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培养液。

一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法，包括以下步骤：

(1)分离、纯化并传代扩增人胎肝间充质干细胞；

(2)将步骤(1)中第3代以后的人胎肝间充质干细胞，于上述的诱导液中培养3-5天，然后加入高糖DMEM/F12培养基(市售即可，通常葡萄糖含量一般为4500mg/L)中继续培养10天以上即得到胰岛β样细胞团。

步骤(2)中所有培养基的加入量参照常规细胞培养时培养基的加入量。

步骤(1)的优选方案是：先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细胞；然后将间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70％～80％融合时，用胰酶进行消化处理，然后按1∶2～3比例传代培养；

(2)取步骤(1)中第3代以后的达到80％～90％融合的人胎肝间充质干细胞，消化、接种后，按加入所述诱导液，每8小时换诱导液一次，连续4天，然后加入含体积分数为10％胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中继续10天以上即得到胰岛β样细胞团。