[发明专利]淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化领域，具体涉及微生物的检测方法。

背景技术

香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis，LH)是一种新发现的可能致人类严重腹泻的 病原菌。香港海鸥形菌2001年首次在香港肝硬化病人的胸腔脓液和血液样本中分离到并被鉴 定为新属种。随后，有人对香港市场出售的淡水鱼进行检测，其中有四分之一的淡水鱼肠道 中都能分离出香港海鸥形菌，且进一步证明该菌是导致人类腹泻的病原菌。自全球首例感染 个案发现以来，研究人员相继在患有胃肠炎的香港和瑞士病人的粪便标本中分离培养出“香 港海鸥形菌”，该研究显示此种新的细菌可能广泛传播于世界各地。

香港海鸥形菌作为一种新发现的食源性病原菌，已确认的生理生化特性如下：革兰染色 呈阴性，氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶和精氨酸双脱氢酶试验呈阳性，鸟氨酸脱羧酶和赖氨 酸脱羧酶试验呈阴性，不发酵乳糖、葡萄糖、蔗糖等。目前尚未对该菌建立一套规范、有效、 快捷、高效的检验技术与检验流程。按传统鉴定方法需做数十种生化试验，检出程序过于复 杂，试验成本高昂，单纯应用PCR诊断，又无法获得分离菌株。

国知局2007年10月31日公开了一项关于香港海鸥形菌检测方法的发明专利申请(申 请号为200710068975.8)，该申请所记载的方法是：取粪便标本接种在含头孢哌酮的麦康凯 培养基上，放入37℃箱内培养48小时取出；挑无色透明、扁平状、直径在0.5～1.0mm之间 的微小菌落进行纯化培养；对培养菌按步骤实验：先进行革兰染色检验，选阴性的短杆菌或 弧菌，然后进行氧化酶和触酶试验，选择二者均为阳性的菌落接种在三糖铁培养基试管内， 置37℃箱内培养24小时取出，选择使鲜红色培养基的颜色保持不变或变得更深的细菌，用 引物5’ttgaggtgcccgaaaggga3’和5’ctacccacttctggcgatt3’进行PCR扩增，当PCR结果为阳 性时即可确认为香港海鸥形菌。该方法虽然简化了传统的鉴定方法，但存在以下问题：1、所 选的三个生化实验之一是三糖铁试验，其主要目的是排除发酵糖类的细菌，由于培养时所用 的麦康凯培养基如果添加了葡萄糖，就可以排除发酵乳糖和葡萄糖的细菌，因此三糖铁试验 的作用仅剩排除发酵蔗糖的细菌；本发明人经试验分析发现经麦康凯培养基培养后筛选出来 的淡水鱼肠道细菌中能发酵蔗糖的比例较低，因此这时三糖铁试验的筛选价值并不大；2、各 生理生化试验的顺序设置不够高效：该方法以革兰染色镜检、氧化酶和触酶试验作为首筛试 验，但是麦康凯培养基本身对革兰染色阳性菌有抑制作用，经麦康凯培养基筛选后可排除大 部分革兰染色阳性菌，而经含头孢哌酮的麦康凯培养基筛选后的淡水鱼肠道细菌中氧化酶和 触酶试验阳性率较高，因此经过革兰染色镜检、氧化酶和触酶试验后可排除的细菌数量并不 多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是建立一种淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的快速检测方法。

本发明解决上述问题的技术方案是：

淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法，该方法由以下步骤组成(简要流程见图1)：

(1)取淡水鱼的粪便，接种在含有头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入温度为37℃培养 箱内培养48小时后取出；

(2)挑取无色、半透明、扁平状和直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落进行纯培养， 得各菌落的纯培养物；

(3)将步骤(2)所得纯培养物按以下步骤进行实验：首先进行常规尿素酶试验，选择 该试验呈阳性的纯培养物进行常规氧化酶和触酶试验，然后取氧化酶和触酶试验均为阳性的 纯培养物采用引物对5‘-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′和5’-AATCTCTTCGAGGTTCGG TA-3’在退火温度为53℃的条件下进行PCR扩增30～35个循环，最后取PCR扩增片段为550bp 的纯培养物进行常规的革兰染色检验，并在显微镜下观察，当观察结果为阴性的短杆菌或弧 菌时，该纯培养物即为香港海鸥形菌。

本发明方法以尿素酶试验作为首筛试验，可以排除麦康凯培养基上的大部分非香港海鸥 形菌的菌落，为后续筛选试验节省了许多工作量；这是因为经含头孢哌酮的麦康凯培养基筛 选后的淡水鱼肠道细菌中尿素酶试验阳性的细菌所占的比例约为10％～25％，经尿素酶试验后 将阴性菌落均全部排除，仅余10％～25％的细菌进入下一个鉴定步骤。本发明方法所提供的PCR 引物对香港海鸥形菌的特异性高达100％，可保证检测结果的准确性。