[发明专利]重组海葵神经毒素rhk2a的修饰产物、其修饰方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术药物制剂领域，具体涉及一种重组海葵神经毒素rhk2a的修饰产物、其修饰方法及应用。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，各种活性蛋白及细胞因子相继被开发成药物应用于临床。而将蛋白类药物制成合适的剂型，以保护其免受外部环境的破坏，延长药物半衰期，降低毒副作用成为一个迫切需要解决的问题。其中，将蛋白质PEG化的研究成为国内外学者关注的热点之一。这是近三十年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术，它将活化的聚乙二醇分子键合到蛋白质分子表面上，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变。研究证实，通过共价键用PEG来修饰蛋白质表面的氨基酸残基可以有效降低蛋白质的免疫原性，提高血浆半衰期，减少给药次数。

2000年中山大学生命科学院从我国南海侧花海葵触手毒腺cDNA文库中筛选的一种具有显著增强心肌收缩作用的活性肽海葵肽类毒素rhk2a，后通过基因工程技术成功表达了这种活性肽，并在专利号为ZL02134651.8、发明名称为一种海葵细胞毒素基因、其编码的蛋白及应用的中国专利中详细论述了所述蛋白质。

有关海葵神经毒素rhk2a的药理学研究结果显示，海葵肽类毒素rhk2a对心脏有非常专一的作用靶点，能和细胞膜上电压依赖性钠通道结合，延迟钠通道的失活，通过间接的钠钙交换，增加胞内钙离子浓度，从而对心肌组织产生非常强的正性肌力作用，且对心率和血压没有明显影响。经豚鼠、兔、犬等多种动物实验均证明，rhk2a能够明显增加心肌收缩力，作用强度约为洋地黄类强心药西地兰的3.5倍。所以，海葵肽类毒素rhk2a在治疗充血性心力衰竭方面有极好的应用前景。

然而进一步研究发现，小鼠腹腔注射rhk2a后1小时内出现四肢痉挛，最后呼吸停止、死亡。另海葵肽类毒素rhk2a稳定性差，增强心肌收缩的作用时间小于1个小时，导致至今仍无法应用于临床，详见欧阳平等在第一军医大学学报，2005，(1)中有关重组海葵肽类毒素rhk2a对急性心功能不全犬左心功能的影响论述；刘彦波等在第一军医大学学报，2004，(3).中有关重组海葵肽类毒素rhk2a对慢性充血性心力衰竭新西兰兔左心功能的影响的论述；以及2004年中山大学的王磊关于重组海葵神经毒素在大肠杆菌中高表达、纯化、活性、构效关系及作用机理的研究中都作了相关论述。另一方面，rhk2a对小鼠的LD50值为1.4mg/kg，以往研究显示，海葵毒素Ap-A、Ap-B对小鼠的LD50分别为66μg/kg和8μg/kg(Notron，1991)，相比较而言，rhk2a的毒性相对较低，说明其具有重要的临床价值。

修饰是一种解决毒性的途径。随着被修饰蛋白质多肽种类的增加，发现最初的随机修饰方法对某些蛋白质多肽药物的改善并不能达到预期的效果，如成分复杂、分离困难、活性大大下降、有效成分少。进而研究人员发现通过定点修饰方式、PEG修饰剂和反应pH等的优化选择可以避免随机修饰的盲目性，这样既不影响蛋白质多肽活性中心结构，又能选择性干扰某些抗原位点，从而达到特定的修饰目的。PEG定点修饰蛋白质多肽的方式据所修饰基团的不同，主要可分为4类：(1)N端氨基定点修饰；(2)巯基定点修饰；(3)氨基定点修饰；(4)糖类残基和N端氧化后定点修饰。现阶段主要以巯基和N端氨基定点修饰为主，如2006年申请美国专利的PEG化粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)和PEG化白细胞介素-10(PEG-IL-10)便是N端氨基定点修饰产物，干扰素β(IFN-β)的巯基定点修饰在2003年申请了美国专利。

但目前仍没有见到有关对重组海葵肽类毒素rhk2a进行修饰以降低其毒性的技术报道，因此，如何获得可行的技术方案，通过rhk2a进行修饰获得低毒稳定的重组海葵神经毒素，改善该蛋白的药物动力学以提高体内外稳定性及给药便利程度，使rhk2a发挥重要的临床应用，一直是研究的重点和迫切点。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种重组海葵神经毒素rhk2a的修饰产物，以满足重组海葵神经毒素rhk2a在临床应用方面的需求。

本发明另一个目的是具体提供所述重组海葵神经毒素rhk2a修饰产物的修饰方法。

本发明还有一个目的是提供所述重组海葵神经毒素rhk2a修饰产物在制备高效低毒的治疗充血性心力衰竭药物方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：