[发明专利]一种人3号染色体计数探针的制备方法及其应用无效
申请号: | 200910039405.5 | 申请日: | 2009-05-12 |
公开(公告)号: | CN101886101A | 公开(公告)日: | 2010-11-17 |
发明(设计)人: | 李明;何瑰;陈娟 | 申请(专利权)人: | 中山大学达安基因股份有限公司 |
主分类号: | C12P19/34 | 分类号: | C12P19/34;C12Q1/68;G01N21/64 |
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地址: | 510665 广东省广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 染色体 计数 探针 制备 方法 及其 应用 | ||
1.一种人3号染色体计数探针的制备方法,其特征在于制备步骤包括:
(1)引物设计:人3号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证。
(2)克隆质粒制备:配制PCR反应体系,以人基因组为模板进行PCR扩增,将纯化后的目的产物与载体pMD18-T连接,制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-C3。
(3)C3探针制备:可采用以下两种方法进行制备。
方法一:以包含目的片段的质粒pMD18-T-C3DNA为模板,进行PCR扩增,通过PCR反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中,然后经过PCR产物纯化、浓缩、定量;对纯化后的PCR产物进行荧光标记、纯化、计算标记效率、定量,而获得C3探针,避光、-20℃储存。
方法二:以包含目的片段的质粒pMD18-T-C3DNA为模板,使用荧光素标记的dUTP直接进行PCR扩增,将PCR产物标记荧光,然后进行纯化、计算标记效率、定量,定量,而获得C3探针,避光、-20℃储存。
(4)C3探针验证:使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。
2.根据权利要求1的方法,其特征还在于其中PCR扩增引物序列分别为上游引物5’-TCTGCAAGTGGATATTTAAA-3’和下游引物5’-TGAGTTGAACACACACGTAC-3’。
3.根据权利要求1的方法,其特征还在于其中克隆质粒制备步骤和C3探针制备步骤中PCR扩增条件均为:95℃ 5分钟;(94℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 45秒)×40循环;72℃ 10分钟。
4.根据权利要求1的方法,其特征还在于其中C3探针标记的荧光素包括活化的荧光染料和/或荧光素标记的dUTP。
5.一种人3号染色体计数试剂盒,包括:1)杂交液、DAPI复染剂,和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒,其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的C3探针、未标记的竞争性DNA和H2O配制而成,其特征在于每人份杂交液中使用C3探针的量为40~60ng,杂交缓冲液为7ul,未标记的竞争性DNA为1.5ug。
6.根据权利要求5的试剂盒,其特征还在于杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50%~70%。
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