[发明专利]一种人3号染色体计数探针的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种人3号染色体计数探针的制备方法，其特征在于制备步骤包括：

(1)引物设计：人3号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证。

(2)克隆质粒制备：配制PCR反应体系，以人基因组为模板进行PCR扩增，将纯化后的目的产物与载体pMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-C3。

(3)C3探针制备：可采用以下两种方法进行制备。

方法一：以包含目的片段的质粒pMD18-T-C3DNA为模板，进行PCR扩增，通过PCR反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中，然后经过PCR产物纯化、浓缩、定量；对纯化后的PCR产物进行荧光标记、纯化、计算标记效率、定量，而获得C3探针，避光、-20℃储存。

方法二：以包含目的片段的质粒pMD18-T-C3DNA为模板，使用荧光素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，然后进行纯化、计算标记效率、定量，定量，而获得C3探针，避光、-20℃储存。

(4)C3探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

2.根据权利要求1的方法，其特征还在于其中PCR扩增引物序列分别为上游引物5’-TCTGCAAGTGGATATTTAAA-3’和下游引物5’-TGAGTTGAACACACACGTAC-3’。

3.根据权利要求1的方法，其特征还在于其中克隆质粒制备步骤和C3探针制备步骤中PCR扩增条件均为：95℃ 5分钟；(94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒)×40循环；72℃ 10分钟。

4.根据权利要求1的方法，其特征还在于其中C3探针标记的荧光素包括活化的荧光染料和/或荧光素标记的dUTP。

5.一种人3号染色体计数试剂盒，包括：1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的C3探针、未标记的竞争性DNA和H₂O配制而成，其特征在于每人份杂交液中使用C3探针的量为40～60ng，杂交缓冲液为7ul，未标记的竞争性DNA为1.5ug。

6.根据权利要求5的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50％～70％。