[发明专利]具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶，及其在杀狄斯瓦螨中的应用，该组合几丁质酶包括几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB。 

背景技术：

蜜蜂寄生螨一直是世界养蜂业最主要的危害之一，在全球范围危害，目前除澳大利亚、非洲部分地区尚未发现蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨(俗称大蜂螨)(Varroa destructor Anderson&Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼虫的体液，造成蜜蜂体质下降，蜂群群势衰弱；此外，蜂螨还传播蜜蜂细菌和病毒病害。据报道，最近在美国等国出现的蜜蜂蜂群崩溃失调病(CCD)也与蜂螨的危害有关。每年我国养蜂业仅蜂螨造成的直接损失就达到几个亿人民币，而且因防治蜂螨使用药物造成蜂产品污染的间接损失更是不可估量。 

目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3种：(1)物理机械法：如蜂群的热处理；(2)化学防治法：如使用杀螨剂如有机酸和香精等；(3)生物技术防治法：包括蜜蜂饲养管理技术。但是目前使用最广泛的主要还是用药物来防治大蜂螨，其中使用最为普遍的是一种以拟除虫菊酯类农药-氟胺氰菊酯为主要原料的杀螨剂“螨扑”(Apistan)。不可否认，药物治螨起了一定的积极作用。但是，连续和大范围使用导致的污染和抗药性问题越来越严重。显然单靠药物治螨是不够的，还必须寻找其它途径来防治蜂螨。 

一些生物防治技术已应用于防治蜂螨，如(1)割除雄蜂房法：自从西方蜜蜂身体上发现蜂螨，也发现蜜蜂对于蜂螨有清除行为，并可减轻蜂螨对蜂群所造成的危害。与此同时，养蜂工作者在实践中发现，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，减弱蜂螨对蜂群所造成的危害。(2)使用抗螨除虫多功能巢础：利用蜂螨繁殖于封盖房，寄生于蜂体上这一生物学特性，直接把杀螨药物藏于蜂房中，阻断蜂螨幼虫在雄蜂房中正常羽化成成螨，从而达到杀灭蜂螨这一目的。(3)人工选育抗螨新品种：中华蜜蜂对于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群内虽曾发现蜂螨，但未给蜂群造成危害。而且西方蜜蜂对于蜂螨也有一定的清理行为，养蜂工作者可以在蜂群中选择对蜂螨有较强清理行为的蜜蜂为种群，定向培育抗螨性强的蜂群，包括蜜蜂营养杂交(又称为蜜蜂无性杂交)。(4)利用病原真菌：绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)和Hirsutella thompsonii对大蜂螨具有一定的防治效果。 

但是，这些措施对蜂螨的控制效果并不令人满意，如割除雄蜂房法很难彻底消除螨害； 由于长期以来自养自繁的养蜂模式导致的蜜蜂严重混杂退化和近亲繁殖衰退现象，培育抗螨品系的稳定性也不尽人意；病原真菌的应用仍受制于更有效品系的筛选、蜂巢温湿度、贮存方法和施用技术。因此，养蜂界仍在严重依赖业已产生抗性和引起残留的化学农药防治蜜蜂害螨。抗生素和化学农药的滥用，已经对我们的食品安全和国际贸易造成巨大的威胁。因此，养蜂业急需安全防治蜂螨的替代防治方法，热切期待环境友好的蜜蜂螨害防治新技术。 

几丁质酶能够催化水解几丁质，产生几丁寡糖或几丁二糖。在自然界中很多微生物可以产生几丁质酶。几丁质酶具有广泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍应用；另外，几丁质酶对杀虫剂有增效作用，可加速害虫的致病过程；几丁质酶还可抑制病原真菌的生长。但是，到目前为止，未发现利用几丁质酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的报道。 

发明内容：

本发明目的是提供了一种具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用，该组合几丁质酶包括几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB。 

本发明是通过以下技术方案予以实施的： 

本发明从沙雷氏菌GEI Serratia marcescens GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，该基因的编码蛋白对狄斯瓦螨具有比较强的毒性，几丁质酶活力为15.9U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为40％。经过测序分析表明，该基因的开放读码框含有1692个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示，BLAST分析表明该基因与登录号为AF454462.1的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的相似性为96％，由此认为该基因属于几丁质酶基因chiA类别，是一个几丁质酶基因chiA类的新序列，推测其编码的几丁质酶ChiA为61.09KDa。