[发明专利]一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用

说明书

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用。

背景技术

石油作为一种非常重要的能源在世界范围被广泛使用，由其带来的污染越来越严重。据不完全统计，每年通过各种渠道泄入水体的石油和石油产品约占全球石油总产量的0.5％，约为200～1000万吨。我国近海水域水质含油量超过国家规定2～8倍，污染状况十分严峻。

石油是一种复杂的多组分混合物，其主要组成是烃类(烷烃和芳烃等)。其中PAHs(多环芳烃)是毒性很强的物质，除可影响水生生物生理、繁殖与行为外，甚至可直接触杀水生生物。PAHs等大多属于憎水性的持久性有机污染物(POPs)，在环境中难以被降解，一方面易富集于水生生物的组织和器官中，长期释放其毒性，另一方面可通过食物链进入人体，对人类健康造成严重危害。

生物修复技术因其具有无二次污染、处理费用低等优点，在石油污染治理方面逐渐成为核心。近年来，国内外学者在此领域做了大量研究，发现细菌中降解石油的属有假单胞菌属、黄杆菌属、棒状杆菌属、无色杆菌属、节杆菌属、不动杆菌属、小球菌属等菌等。

目前大部分研究工作筛选的单一石油降解菌只能利用石油中一种或几种烃类；同时，石油中各组分完全生物氧化需要消耗大量的氧，据测算1克石油被微生物矿化需要3～4克氧，而1升石油，则需要消耗40万升水体中的溶解氧。在石油污染严重的水域，氧可能成为石油降解的限制因子。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用，本发明针对上述现有水体石油污染生物修复技术所面临的问题，设计降解机理互补、协同作用好的混合菌剂，同时利用藻提供O₂，解决污染水域供氧不足问题。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种藻菌混合微生物制剂，由无菌纯栅藻、烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)、菲高效降解菌GY2B(sphingomonas)、芘降解菌GP3：GP3A(Pseudomonas)，GP3B(Pandoraeapnomenusa)组成；所述无菌纯栅藻是由栅藻除菌纯化后得到。

三种石油组分降解菌株为本课题组前期工作分离筛选所得，已经对其进行菌种鉴定，提交16SrDNA序列号至GenBank，并在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。菲高效降解菌GY2B(sphingomonas)，GenBank登录号DQ139343，保藏编号为CCTCC M 206019；芘降解菌GP3：GP3A(Pseudomonas)，GenBank登录号为EU233280，保藏编号为CCTCC NO：M 207166；GP3B(Pandoraea pnomenusa)的登录号为EU233279，保藏编号为CCTCC NO：M207167；烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)，登录号为EU282110，保藏编号为CCTCCM207169。

所述的一种藻菌混合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤

(1)利用平板分离法得到单种栅藻；

(2)用溶菌酶缓冲液对栅藻进行预处理；

(3)利用抗生素对栅藻进行除菌，得到无菌纯栅藻；

(4)微生物接种量为：纯栅藻与总石油组分降解菌按照2∶1体积比例接种培养基，总石油组分降解菌为GS3C、GY2B、GP3A和GP3B按照等体积比混合；

(5)扩大培养条件：培养基为BG11培养液，在温度为25±1℃，转速150rmp的光照摇床培养，光照强度为8000LX，光暗比L/D＝14∶10，将接种后的培养液扩大培养培养7～10天，即得本发明的藻菌混合微生物制剂。

所述的溶菌酶缓冲液中Tween80浓度为0.005mol/l，EDTA浓度为0.1mol/l，SDS浓度为0.25mol/l，溶菌酶浓度为0.5mg/ml。

所述的预处理为在栅藻中加入溶菌酶缓冲液放置10分钟后，离心倒掉上清液，加入灭菌蒸馏水重复洗涤三次；

所述的抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平和四环素中的一种以上。

优选青霉素+庆大霉素组合，能将栅藻所带细菌全部去除而得到无菌栅藻。

所得栅藻形态学特征为：藻细胞为真性定形群体，扁平，4个细胞为一组，群体细胞并排成一列，细胞纺锤形，上下两端逐渐尖细，群体两侧细胞凸出，细胞壁平滑。